基因編輯（gene editing）,又稱基因組編輯（genome edting）或基因組工程（genome engineering）,是通過對(duì)生物體某些特定的基因進(jìn)行比較精確的增添或者刪減從而滿足人類的某些需求衍生出的一項(xiàng)基因工程技術(shù)或過程。與傳統(tǒng)的基因工程相比較,基因編輯可以直接作用于細(xì)胞染色體的特性,使得其實(shí)用性獲得了更大的提升。CRISPR/Cas是目前基因編輯領(lǐng)域最前沿最火熱的基因編輯技術(shù),其低成本高效率易操作的優(yōu)點(diǎn)大大促進(jìn)了基因編輯技術(shù)的發(fā)展。CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛存在于自然界細(xì)菌和古生菌中,是細(xì)菌和古生菌面對(duì)外源DNA的入侵而產(chǎn)生的一種自我免疫的機(jī)制。對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9和V型Cpf1具有基因編輯的作用,其中CRISPR-Cas9最具有典型性,但是CRISPR-Cas9也存在著對(duì)某些生物不相融,高脫靶率的問題。通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室自行分離純化得到的維吉尼亞鏈霉菌IBL14（Streptomyces virginiae IBL14）的全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)其染色體的兩個(gè)CRISPR位點(diǎn)之間存在著一個(gè)Cas順序?yàn)閏as7,cas5,cas3,c... 

【文章來源】：安徽大學(xué)安徽省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫原理

制藥廠污泥中發(fā)現(xiàn)并分離提純而來的一種放線菌，在革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其為陽性菌株，初步實(shí)驗(yàn)后本實(shí)驗(yàn)室委托蘇州眾信生物技術(shù)有限公司對(duì)IBL14進(jìn)行了全基因組的測(cè)序。通過全基因組的分析發(fā)現(xiàn)該生物存在著cas3介導(dǎo)的CRISPR-Cas系統(tǒng)，之后的對(duì)比分析中我們可以確認(rèn)該系統(tǒng)屬于Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的一個(gè)亞型[25]。對(duì)IBL14全基因組進(jìn)行分析時(shí)我們發(fā)現(xiàn)其存在著18個(gè)CRISPER位點(diǎn)，其中兩個(gè)位點(diǎn)之間存在著一個(gè)Cas順序?yàn)閏as7,cas5,cas3,cas4,cas1,cas2的蛋白群，他們位于同一操縱子上，我們將其命名為I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)[26]。圖1.3I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Figure1.3thestructureofI-B-sviCRISPR-Cassystem本實(shí)驗(yàn)室對(duì)I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)的開發(fā)一直都在緊鑼密鼓的進(jìn)行著，其中雍德祥[27]，許鑫[28]，邱彩花[29]對(duì)利用本系統(tǒng)自打靶做出了突出貢獻(xiàn)，楊興旺[30]，孫焰[31]利用該系統(tǒng)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了基因編輯,夏婷婷[32]拓展了本系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的應(yīng)用，曹素麗[33]一直在進(jìn)行原始菌株的工作。唐嚴(yán)嚴(yán)[34]更是實(shí)現(xiàn)了該系統(tǒng)在人體細(xì)胞中基因編輯的突破。王安靜[35]利用I-B-sviCRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)真核微生物進(jìn)行了基因敲除。1.3研究的意義內(nèi)容和方案1.3.1CRISPR-Cas系統(tǒng)指導(dǎo)基因組編輯的分子原理當(dāng)同源DNA序列存在時(shí)，宿主基因組中末端錯(cuò)位的致命雙鏈斷裂(DSB)DNA通�？梢酝ㄟ^細(xì)胞自身的同源指導(dǎo)修復(fù)(HDR)機(jī)制(頻率較低，錯(cuò)誤較少)修復(fù)[36]，這種修復(fù)通過將兩端分別有兩個(gè)互補(bǔ)序列的工程同源DNA片段(或模板DNA/t-DNA)引入到DSB產(chǎn)品的末端來構(gòu)建基因組編輯的基礎(chǔ)[37]。此外當(dāng)缺乏同源DNA序列時(shí)尤其是缺失鈍端

第一章緒論4的基因組DSB產(chǎn)品中，會(huì)出現(xiàn)非同源性末端接合(NHEJ)(頻率更高，錯(cuò)誤更多)，這通常會(huì)導(dǎo)致核苷酸插入或缺失(indels)1的幀移位突變[38]。在CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的內(nèi)源性基因組編輯中，一系列基因編輯工具(通常包括t-DNA、g-DNA、Cas、遺傳標(biāo)記和載體/質(zhì)粒)導(dǎo)入宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的分子事件主要包括:(i)Cas基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯(通常包括t-DNA和載體的重復(fù))，(ii)g-DNA的轉(zhuǎn)錄和加工形成crRNA，(iii)Cas對(duì)內(nèi)源性DNA的定點(diǎn)切割，(iv)靶基因序列與t-DNA的同源重組。顯然事件(i)和(iv)完全由宿主細(xì)胞和質(zhì)粒中的分子組分實(shí)現(xiàn)，只有事件(ii)和(iii)應(yīng)由Cas(es)1,2完成。實(shí)際上通過對(duì)crRNA進(jìn)行優(yōu)化，將由啟動(dòng)子、crRNAcDNA和終止子組成的g-DNA整合到載體中，可以很容易地實(shí)現(xiàn)上述功能[39]。因此基因組編輯中的事件(iii)是一個(gè)關(guān)鍵步驟應(yīng)該通過具有相同功能的限制性內(nèi)切酶來實(shí)現(xiàn)。圖1.4CRISPR-Cas系統(tǒng)指導(dǎo)基因組編輯的分子原理Figure1.4ThemolecularprincipleofCRISPR-Cassystemguidinggenomeediting1.3.2本課題的研究意義探究堿基優(yōu)化后的I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)在釀酒酵母進(jìn)行的基因敲除具有重要的意義，首先能夠補(bǔ)充該系統(tǒng)在真核生物探究的缺失，進(jìn)一步證明維吉尼亞鏈霉菌自身的CRISPR-Cas系統(tǒng)可應(yīng)用到其它生物中。其次為基于2類II型與V型CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行的真核生物基因編輯提供了新的補(bǔ)充和選擇。最后應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)真核生物釀酒酵母基因組可方便、快速、有效地進(jìn)行基因編輯。對(duì)脫靶實(shí)驗(yàn)的探究讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)更加的嚴(yán)謹(jǐn)也論證了我們對(duì)該系統(tǒng)低脫靶率的推理。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]番茄紅素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠糖脂代謝及炎癥水平的影響[J]. 張配配,李景賢,李蒙麗,隋源,周鈺浩,孫永葉.  衛(wèi)生研究. 2020(02)
[2]Cpf1核酸酶的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備與鑒定[J]. 董彬,王君,孫靜,王報(bào)貴,孫春龍,吳濤.  生物學(xué)雜志. 2020(06)

碩士論文
[1]I-B-Svi型CRISPR-Cas3系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因編輯[D]. 唐嚴(yán)嚴(yán).安徽大學(xué) 2019
[2]I-B-Svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的基因編輯[D]. 夏婷婷.安徽大學(xué) 2019
[3]釀酒酵母合成番茄紅素的途徑優(yōu)化研究[D]. 李霞.石河子大學(xué) 2018
[4]維吉尼亞鏈霉菌IBL14中sviscsn基因簇功能分析[D]. 許鑫.安徽大學(xué) 2017
[5]維吉尼亞鏈霉菌IBL14中I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)及青霉素代謝相關(guān)酶基因自敲除[D]. 邱彩花.安徽大學(xué) 2017
[6]維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其基因編輯方法[D]. 雍德祥.安徽大學(xué) 2016



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