研究背最及目的:口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,每年有超過(guò)28萬(wàn)新增的病例。中國(guó)是口腔鱗癌的高發(fā)地區(qū),近年來(lái)的發(fā)病呈上升趨勢(shì)。雖然目前已有新型的化療方法和靶向治療藥物應(yīng)用于臨床,但其效果不甚理想,因此我們需深入了解口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。Hippo信號(hào)通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子YAP已被報(bào)道在肝癌、肺癌等腫瘤組織中表達(dá)異常。因此,本課題旨在探討YAP對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL27的增殖和凋亡的影響,并研究其在體內(nèi)體外促腫瘤的作用和機(jī)制,為YAP基因作為口腔鱗癌治療新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:1.用免疫組化法檢測(cè)不同分化程度的口腔鱗癌和正常口腔上皮組織中YAP蛋白的表達(dá)情況。2.檢測(cè)YAP在4株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平,并選擇CAL27作為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)材料。利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染CAL27細(xì)胞,分別構(gòu)建敲除和過(guò)表達(dá)YAP基因及對(duì)照組的口腔鱗癌細(xì)胞系。通過(guò)QRT-PCR及Western blot檢測(cè)敲除和過(guò)表達(dá)效率。3.利用CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn),EdU染色法,克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)敲除和過(guò)表達(dá)YAP對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)YAP對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。通... 

【文章來(lái)源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１：?ＹＡＰ在口腔鱗癌中的表達(dá)水平??

ＹＡＰ蛋白在口腔鱗癌細(xì)胞系的作用。為此，我們選擇了?４種口腔來(lái)源的鱗癌細(xì)??胞系０耍保蓿玻貳?耍玻擔(dān)場(chǎng)⒍。鞍耍福保保澈兔瘢趕赴???茫ǎ?保倍。?浚埃焙停埽ぃ叮擔(dān)保叮保保蓿暴枺奔?xì)e崳?測(cè)ＹＡＰ基因和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ＹＡＰ基因和蛋白的表達(dá)水平在??Ａ２５３細(xì)胞中表達(dá)水平最低，而在ＴＣＡ８１１３細(xì)胞中表達(dá)水平最高（圖２－１Ａ、圖??２－１Ｂ）。最后，我們選擇ＣＡＬ２７細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。我們利用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)??定敲除和過(guò)表達(dá)ＹＡＰ的ＣＡＬ２７細(xì)胞系，嘌呤霉素篩選，ＣＡＬ２７細(xì)胞在明場(chǎng)和??藍(lán)色熒光下形態(tài)如圖所示（圖２－１Ｃ、圖２－１Ｄ）。??Ａ．?Ｂ．?虧??＞?．??ｉ－＇?１??ＹＡＰ?—＞?彡??ｇａｐｄｈ?ｍｍ?ｍａｍ?％?２?＼?￣?＇??Ａ２５３?ＫＢ?ＣＡＬ２７?ＩＣＡ８Ｍ３．?｜?｝ｕ?ＨＨＩ??３?Ａ：？?？?＇Ｉ?：？?ＫＢ?ｒＣＡＭＩ＊??ｃ?１）．?＿＿＿＿＿＿＿＿??■?■??圖２－１：細(xì)胞系的篩選及轉(zhuǎn)染??Ａ、Ｂ：?ＹＡＰ在四種口腔鱗癌細(xì)胞系中表達(dá)情況；Ｃ、Ｄ：明場(chǎng)和藍(lán)色熒光??下?ＣＡＬ２７?細(xì)胞的情況?＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１．??２）穩(wěn)定敲除和過(guò)表達(dá)ＹＡＰ基因ＣＡＬ２７細(xì)胞的構(gòu)建??隨后，我們利用ＱＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ技術(shù)檢測(cè)敲除和過(guò)表達(dá)效率。結(jié)??果顯示，在敲除ＹＡＰ后，ＹＡＰ及其下游靶基因ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１及ＡＮＫＲＤ表??達(dá)水平均降低（Ｐ＜〇．〇５）（圖２－２Ａ）；過(guò)表達(dá)ＹＡＰ后，ＹＡＰ及其靶基因均升??高

（０．５６４?±０．０３３）較ｓｈ－ＮＣ?（０．８０２?±０．００７）要低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義??（Ｐ＜０．００１），而在隨后的第四、五、六天也保持著這種差異。但在第七天，兩??者間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)與細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板有關(guān)（圖２－３Ａ）。ＥｄＵ染色結(jié)??果顯示，ｓｈ－ＹＡＰ組細(xì)胞陽(yáng)性著色比例（３２．６３９±２．６８３）較ｓｈ－ＮＣ組（４８．５４４土??４．５８２）要低（圖２－３Ｂ、圖２－３Ｃ），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０１），說(shuō)明ｓｈ－??ＹＡＰ組處于分裂期的細(xì)胞較ｓｈ－ＮＣ組要少�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在敲除??ＹＡＰ基因后，ｓｈ－ＹＡＰ組克隆形成數(shù)目較ｓｈ－ＮＣ組要少（圖２－３Ｄ、圖２－３Ｅ），??差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Bcl-2基因多態(tài)性與食管癌及癌前病變發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性[J]. 袁麗,郭碩,曹穎,郝建影,張立瑋.  腫瘤. 2015(12)
[2]口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床流行病學(xué)研究現(xiàn)狀[J]. 鄭家偉,李金忠,鐘來(lái)平,張志愿.  中國(guó)口腔頜面外科雜志. 2007(02)
[3]舌鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后因素的探討[J]. 楊凱,溫玉明,李龍江,王昌美,王濤,李文.  華西口腔醫(yī)學(xué)雜志. 2001(03)



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