纖維素是地球上分布范圍廣泛、含量豐富的天然高分子多糖類物質。它的高效利用可以解決資源枯竭、環(huán)境污染等重大問題。纖維素酶是多組分酶,其中β-葡萄糖苷酶是降解纖維素的關鍵限速酶。本研究以嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）為實驗材料,對糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶活性通道內的非保守氨基酸以及酶催化中心可能與底物結合的保守氨基酸進行了定點突變,研究突變酶的酶學性質,篩選出了酶與底物結合的關鍵氨基酸位點及熱穩(wěn)定性強的突變酶。主要研究結果如下:克隆了來自嗜熱毛殼菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶的基因bgl3,將其導入畢赤酵母中表達,對表達的蛋白進行分離和純化。SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化產物,蛋白大小為120kDa,比預測的理論分子量大,說明蛋白翻譯過程中發(fā)生了糖基化的修飾,得到野生酶BGL3。BGL3的比活力為36.1U/mg,酶促反應最適溫度和pH值分別為60℃和5.0。K_m、k_cat、k_cat/K_m值為4.27±0.032mM、20.16±0.13s^-1

【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

-1β-葡萄糖苷酶的反轉型和保留型催化機制Fig.1.3-1Reversedandretainedcatalyticmechanismofβ-glucosidase

2.5-1 嗜熱毛殼菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶蛋白結構模綠色：突變位點；紅色：酶活性位點；藍色：葡萄糖2.5-1 protein structural model of GH3 β-glucosidase from C. thermoGreen: mutation site; Red: enzyme activity site; Blue: glucose物設計表 2.5-2 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突變位點引物序列2 Non-conservative amino acid mutation site primer sequences of βame Primer sequence FP: TTGGCAGGAT GCCTGCTGGTGCTCGGAATTGGGRP:AGCACCAGCAGGCATCCTGCCAAGTGGGCCAGC FP: GTGCTAAGCATCTTATTGGCTACGAGCAAGAACRP: GTAGCCAATAAGATGCTTAGCACAGGCAATAACA FP: GAGTTGGTTCCGTCATGTGCTCCTACAACCAGGTRP: GGAGCACATGACGGAACCAACTCCGGCACGAAC FP: TTGGCTTCCAGGGTTTCGTTCAGAGCGACTGGCA

山東農業(yè)大學碩士學位論文B: 5ju6），二者序列的相似度為 62.74%。利用 PDBsum 網站分析 Cel3A（PDB: 5ju6）的蛋白結構信息，尋找酶與底物結酸位點（圖 2.5-3）。根據(jù) Cel3A 蛋白的二級結構和 Clustal 軟件，分析得出 B酸序列中 V67、D85、R91、L134、R149、K182、H183、R193、M234、Y2370 位點可能在酶催化水解底物時發(fā)揮關鍵的作用。將這些氨基酸位點都突變?yōu)锳，研究酶催化中心執(zhí)行主要功能的氨基酸位點，本研究為糖苷水解酶第三家族苷酶的進一步分子改造提供一定的參考。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]嗜熱真菌糖苷酶的基因克隆、表達與分子改造[D]. 徐榮燕.山東農業(yè)大學 2010

碩士論文
[1]糖苷水解酶GH12家族活性架構中關鍵氨基酸的功能分析[D]. 李單單.山東大學 2013



本文編號：3419660