纖維素是地球上分布范圍廣泛、含量豐富的天然高分子多糖類(lèi)物質(zhì)。它的高效利用可以解決資源枯竭、環(huán)境污染等重大問(wèn)題。纖維素酶是多組分酶,其中β-葡萄糖苷酶是降解纖維素的關(guān)鍵限速酶。本研究以嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶活性通道內(nèi)的非保守氨基酸以及酶催化中心可能與底物結(jié)合的保守氨基酸進(jìn)行了定點(diǎn)突變,研究突變酶的酶學(xué)性質(zhì),篩選出了酶與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)及熱穩(wěn)定性強(qiáng)的突變酶。主要研究結(jié)果如下:克隆了來(lái)自嗜熱毛殼菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶的基因bgl3,將其導(dǎo)入畢赤酵母中表達(dá),對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行分離和純化。SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純化產(chǎn)物,蛋白大小為120kDa,比預(yù)測(cè)的理論分子量大,說(shuō)明蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)生了糖基化的修飾,得到野生酶BGL3。BGL3的比活力為36.1U/mg,酶促反應(yīng)最適溫度和pH值分別為60℃和5.0。K_m、k_cat、k_cat/K_m值為4.27±0.032mM、20.16±0.13s^-1

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

-1β-葡萄糖苷酶的反轉(zhuǎn)型和保留型催化機(jī)制Fig.1.3-1Reversedandretainedcatalyticmechanismofβ-glucosidase

2.5-1 嗜熱毛殼菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶蛋白結(jié)構(gòu)模綠色：突變位點(diǎn)；紅色：酶活性位點(diǎn)；藍(lán)色：葡萄糖2.5-1 protein structural model of GH3 β-glucosidase from C. thermoGreen: mutation site; Red: enzyme activity site; Blue: glucose物設(shè)計(jì)表 2.5-2 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突變位點(diǎn)引物序列2 Non-conservative amino acid mutation site primer sequences of βame Primer sequence FP: TTGGCAGGAT GCCTGCTGGTGCTCGGAATTGGGRP:AGCACCAGCAGGCATCCTGCCAAGTGGGCCAGC FP: GTGCTAAGCATCTTATTGGCTACGAGCAAGAACRP: GTAGCCAATAAGATGCTTAGCACAGGCAATAACA FP: GAGTTGGTTCCGTCATGTGCTCCTACAACCAGGTRP: GGAGCACATGACGGAACCAACTCCGGCACGAAC FP: TTGGCTTCCAGGGTTTCGTTCAGAGCGACTGGCA

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文B: 5ju6），二者序列的相似度為 62.74%。利用 PDBsum 網(wǎng)站分析 Cel3A（PDB: 5ju6）的蛋白結(jié)構(gòu)信息，尋找酶與底物結(jié)酸位點(diǎn)（圖 2.5-3）。根據(jù) Cel3A 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和 Clustal 軟件，分析得出 B酸序列中 V67、D85、R91、L134、R149、K182、H183、R193、M234、Y2370 位點(diǎn)可能在酶催化水解底物時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵的作用。將這些氨基酸位點(diǎn)都突變?yōu)锳，研究酶催化中心執(zhí)行主要功能的氨基酸位點(diǎn)，本研究為糖苷水解酶第三家族苷酶的進(jìn)一步分子改造提供一定的參考。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]嗜熱真菌糖苷酶的基因克隆、表達(dá)與分子改造[D]. 徐榮燕.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010

碩士論文
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本文編號(hào)：3419660