利用CRISPR/Cas9和ES細(xì)胞技術(shù),在小鼠ES細(xì)胞株上敲除小鼠H2-K1基因,為研發(fā)MHCⅠ類基因人源化小鼠打下基礎(chǔ)。設(shè)計了兩個單向?qū)NA（single guide RNA,sgRNA）,分別靶向H2-K1基因的外顯子2和外顯子3。以p X330質(zhì)粒為骨架構(gòu)建表達(dá)sgRNA的打靶載體。用電穿孔轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的質(zhì)粒以及p SUPER-puro共同導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞中,實現(xiàn)基因敲除。在嘌呤霉素篩選后,利用PCR初步檢測靶基因的敲除情況,再通過測序以及流式細(xì)胞分析確定敲除H2-K1基因的小鼠ES細(xì)胞。結(jié)果顯示:利用CRISPR/Cas9技術(shù),小鼠ES細(xì)胞的H2-K1基因被成功敲除,通過PCR檢測到4個克隆為H2-K1單等位基因敲除（19.0%）,2個克隆為H2-K1雙等位基因敲除（9.5%）。經(jīng)過測序以及流式細(xì)胞分析,2株小鼠ES細(xì)胞被確認(rèn)為H2-K1雙等位基因敲除。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到H2-K1基因敲除的小鼠ES細(xì)胞株,為MHCⅠ類基因的敲除和置換提供了參考。 

【文章來源】：中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2017,56(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒和主要試劑
    1.2 sgRNA靶點的選擇及其序列的合成
    1.3 質(zhì)粒構(gòu)建
    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和藥篩
    1.5 m ES細(xì)胞克隆的擴(kuò)增和基因組DNA的提取
    1.6 m ES細(xì)胞基因打靶的鑒定
    1.7 基因打靶細(xì)胞表型鑒定
2 結(jié)果
    2.1 CRSPR/Cas9基因打靶載體的設(shè)計與構(gòu)建
    2.2 小鼠ES細(xì)胞H2-K1基因打靶
    2.3 m ES細(xì)胞克隆基因型鑒定
    2.4 H2-K1基因表達(dá)的鑒定
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]供體同源臂長度對ZFN介導(dǎo)的同源重組效率的影響[J]. 聶宇,喬艷樂,陳瑤生,何祖勇.  中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2016(04)
[2]DNA剪刀——TALEN和CRISPR/Cas[J]. 倪培凌,劉暢,陳凌懿.  中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2014(01)



本文編號：3411915