水貂、狐貍和貉是重要的毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,近些年來(lái),因具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而被大量人工飼養(yǎng)。除作為裘皮加工業(yè)原材料外,去皮后產(chǎn)生的胴體,由于其價(jià)格低廉,時(shí)常被非法加工成畜禽產(chǎn)品,對(duì)食品安全造成了嚴(yán)重威脅。因此,建立毛皮動(dòng)物組織的分子鑒別檢測(cè)技術(shù),對(duì)維護(hù)毛皮動(dòng)物產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。本研究旨在利用Cytb基因從常見(jiàn)肉制品中鑒別貂狐貉組織,并進(jìn)一步利用TYR和12S rRNA基因?qū)Σ煌贩N的水貂進(jìn)行區(qū)分,最后利用mtDNA中D-loop區(qū)的差異性對(duì)相同品種不同水貂個(gè)體進(jìn)行鑒別。首先,本研究根據(jù)GenBank已發(fā)表的水貂、狐貍和貉的Cytb基因序列設(shè)計(jì)了3對(duì)特異引物,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增及酶切驗(yàn)證,并對(duì)各引物的特異性、靈敏度、以及交叉性進(jìn)行分析。同時(shí),優(yōu)化退火溫度并構(gòu)建多重PCR,并對(duì)其特異性、靈敏度、穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。其次,選取水貂的TYR基因和mtDNA中的12S rRNA基因,對(duì)三種不同品種的水貂進(jìn)行基因擴(kuò)增、回收、測(cè)序,并將其結(jié)果進(jìn)行比較分析。第三,選取水貂mtDNA的D-loop區(qū)全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收、純化、克隆、挑菌、測(cè)序,隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示:（1）所建立的多重... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

水貂線粒體基因組結(jié)構(gòu)

mtDNA和TYR基因在區(qū)分貂、狐和貉組織中的應(yīng)用14（9）將吸附柱CB3放回收集管中，12,000g離心2min，棄掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置5min以上，以徹底晾干吸附柱中殘留漂洗液中的乙醇；（10）將晾干后的吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加35μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2min以上，12,000g離心2min，將溶液收集；將提取的DNA模板經(jīng)Nano-600超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定，選取濃度>50ng/μL、OD260nm/OD280nm的數(shù)值在1.8-2.1之間的DNA模板，放置-20℃冰箱進(jìn)行保存。2.2.1.2引物設(shè)計(jì)與合成由于本試驗(yàn)的目的在于建立一個(gè)多重PCR檢測(cè)方法，所以3種毛皮動(dòng)物的引物設(shè)計(jì)必須要保障后續(xù)試驗(yàn)的成功。在多重PCR中，為保證試驗(yàn)的擴(kuò)增效率，3對(duì)引物擴(kuò)增條件應(yīng)相對(duì)一致，為下一步試驗(yàn)提供保障。多重PCR的引物在設(shè)計(jì)在滿(mǎn)足普通PCR的條件外，同時(shí)也需要注意下面幾個(gè)方面：①對(duì)于該方法主要應(yīng)對(duì)常見(jiàn)肉類(lèi)中是否摻雜貂狐貉肉，因此設(shè)計(jì)引物要對(duì)比對(duì)常見(jiàn)動(dòng)物與貂、狐和貉cytb基因序列的進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析（見(jiàn)圖2），②各條引物之間不能互補(bǔ)，尤其是形成二聚體；檢驗(yàn)是否形成二聚體，需要進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增。③擴(kuò)增物種之間的引物序列也不能存在較大的同源性；依據(jù)圖2結(jié)果，對(duì)3種毛皮動(dòng)物和家犬的Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)（見(jiàn)圖3）。④各條引物的Tm盡量相同，保證擴(kuò)增的退火溫度一致。⑤各引物擴(kuò)增的片段大小一定要呈現(xiàn)梯度，而且片段之間的距離要大于200bp以上，來(lái)便于觀察電泳結(jié)果。圖210種動(dòng)物細(xì)胞色素b基因進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2Evolutionarytreeanalysisofcytochromebgenesin10animals

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位論文15圖3貂、狐、貉和犬Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果Fig.3Cytbgenesequencecomparisonofmink,fox,raccoondoganddog根據(jù)NCBI已發(fā)表的水貂Cytb序列（GenBank：KF990329.1）、狐貍Cytb序列（GenBank：DQ498127.1）、貉Cytb序列（GenBank：JX099889.1），依據(jù)圖3比對(duì)的結(jié)果，A、B為水貂上下游引物初始端，C、D為狐貍上下游引物初始端，E、F為貉上下游引物初始端，再根據(jù)其他多重PCR擴(kuò)增條件，利用PrimerPremier6．0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，引物序列如下表1，由北京六合華大基因有限公司合成；并讓其設(shè)計(jì)且合成一對(duì)能夠擴(kuò)增脊椎動(dòng)物的通用引物；上游引物：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，下游引物：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′（1200bp）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3407875