建立基于CRISPR/Cas9的基因轉(zhuǎn)錄激活技術(shù),實(shí)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中激活cGAS基因的轉(zhuǎn)錄。首先利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9的HEK293細(xì)胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鑒定Cas9蛋白質(zhì)表達(dá)效果。再選取不同靶序列,分別構(gòu)建用于激活cGAS基因轉(zhuǎn)錄的sgRNA載體,將構(gòu)建好的序列載體與CRISPR體系工具質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)Cas9的HEK293細(xì)胞中。采用Real-time PCR方法檢測細(xì)胞中內(nèi)源cGAS的轉(zhuǎn)錄激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因轉(zhuǎn)錄激活技術(shù),并在c GAS基因陰性表達(dá)的細(xì)胞中激活基因的轉(zhuǎn)錄。 

【文章來源】：科學(xué)技術(shù)與工程. 2016,16(20)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料
    1.1 主要試劑
    1.2 主要儀器
2 方法
    2.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9的HEK293細(xì)胞
        2.1.1 病毒包裝
        2.1.2 HEK293細(xì)胞的病毒感染
        2.1.3 感染細(xì)胞中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定表達(dá)效果檢測
    2.2 sgRNA靶序列設(shè)計(jì)
    2.3 CRISPR轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建及陽性克隆的篩選
    2.4 鑒定CRISPR調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)
3 結(jié)果
    3.1 Cas9的穩(wěn)定表達(dá)檢測
    3.2 c GAS-sgRNA(MS2)陽性克隆驗(yàn)證及測序
    3.3 c GAS的表達(dá)水平檢測
4 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]COPS3的穩(wěn)定干涉細(xì)胞系建立及其在NLRP3炎癥小體激活中的作用[J]. 郭賽賽,常艷,涂海情,徐廣,秦璇和,吳敏,李慧艷,李愛玲.  科學(xué)技術(shù)與工程. 2015(19)
[2]新型胞質(zhì)DNA感受通路:cGAS-STING的研究進(jìn)展[J]. 丁亮,泥艷紅,胡勤剛,侯亞義.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2014(09)



本文編號：3390159