隨著基因編輯技術的發(fā)展,規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences,CRISPR）結合Cas9蛋白系統(tǒng)已經在擬南芥、水稻和玉米等二倍體作物中得到了廣泛應用。由于小麥是異源六倍體作物,基因組結構比較復雜,農桿菌介導CRISPR/SpCas9系統(tǒng)對小麥內源基因進行編輯的效率一直不高,特別是最新研發(fā)的CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9系統(tǒng),在小麥中還未見相關報道,本研究擬利用之前研究中獲得的無篩選標記材料H29,建立高效的小麥基因編輯系統(tǒng),進而對小麥內源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG進行編輯,并對突變體進行表型鑒定和功能分析。主要研究結果如下:1.利用OsU6a、TaU3和TaU6啟動子構建調控sgRNA表達的CRISPR/SpCas9載體,農桿菌介導對無篩選標記材料H29中的外源GUS基因進行編輯,發(fā)現(xiàn)TaU3調控sgRNA時的編輯效率最高（61.4%）。然后利用TaU3作為sgRNA的啟動子,構建包含2個串聯(lián)靶向外源GUS基因靶序列的編輯... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：165 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯（DOUDNAetal.,2014）

中國農業(yè)科學院博士學位論文第一章緒論16體的誘導率，加速作物的育種進程；對TaQ基因發(fā)生編輯的突變體植株，研究其控制穗部形態(tài)的分子機制；對TaWaxy基因發(fā)生編輯的突變體植株，研究籽粒直鏈淀粉和支鏈淀粉含量對小麥品質的影響；對TaARG基因發(fā)生編輯的突變體植株，研究TaARG基因參與植物體內氮代謝過程的調控機制。研究結果為利用CRISPR編輯技術對小麥重要內源基因進行高效遺傳修飾和在小麥中實現(xiàn)目標基因的定點插入等研究奠定基矗另外，本研究創(chuàng)制的突變體材料對于小麥單倍體育種、高產育種、品質育種和抗逆性改良等具有重要的應用價值。1.7技術路線本研究首先用實驗室之前獲得的無篩選標記轉基因小麥株系H29（只含有外源GUS基因）為材料，比較CRISPR/SpCas9系統(tǒng)中不同sgRNA啟動子OsU6a、TaU3和TaU6對外源GUS基因的編輯效率，篩選出sgRNA的最優(yōu)啟動子，然后在CRISPR/SpCas9、CRISPR/Cpf1和CRISPR/xCas9系統(tǒng)中利用優(yōu)選的啟動子構建2個靶向外源GUS基因的串聯(lián)sgRNA，比較不同CRISPR系統(tǒng)的編輯效率。最后，利用優(yōu)化的CRISPR/SpCas9系統(tǒng)編輯小麥內源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG，對編輯植株在分子生物學、細胞生物學、解刨學、農藝性狀、品質性狀和生物化學等層面上進行鑒定和研究，具體技術路線如圖1-2所示。圖1-2本研究技術路線圖Fig.1-2Technologyroadmapofthisstudy

中國農業(yè)科學院博士學位論文第二章小麥農桿菌介導高效基因編輯體系建立18SYBRqPCRMasterMix購自南京諾唯贊科技有限公司。圖2-1pWMB110載體結構圖Fig.2-1StructureofexpressionvectorpWMB1102.1.3引物序列本研究所需的xCas9序列以及各種引物序列由生工生物工程上海股份有限公司合成，各種PCR擴增產物的測序由北京擎科生物科技有限公司完成。所需的引物序列見附錄A。2.2實驗方法2.2.1染色體原位雜交檢測參照YUAN等（2015）的方法，具體步驟如下：1.將成熟種子浸泡后放于鋪有濾紙的無菌水中，室溫放置3-4d，待主根長度達2.5cm左右時，取長度約1cm根尖組織，放于離心管中，并在N2O中處理2h。2.用95%的冰醋酸固定根尖5min，吸出冰醋酸，用無菌水清洗2次。3.取出根尖用濾紙吸去水分，切取根尖生長點部位組織，放入由裂解酶、離析酶和果膠酶配置的裂解酶中，根據(jù)根尖情況在37℃水浴鍋中裂解55-58min。


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