隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展,規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences,CRISPR）結(jié)合Cas9蛋白系統(tǒng)已經(jīng)在擬南芥、水稻和玉米等二倍體作物中得到了廣泛應(yīng)用。由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w作物,基因組結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,農(nóng)桿菌介導(dǎo)CRISPR/SpCas9系統(tǒng)對(duì)小麥內(nèi)源基因進(jìn)行編輯的效率一直不高,特別是最新研發(fā)的CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9系統(tǒng),在小麥中還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,本研究擬利用之前研究中獲得的無(wú)篩選標(biāo)記材料H29,建立高效的小麥基因編輯系統(tǒng),進(jìn)而對(duì)小麥內(nèi)源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG進(jìn)行編輯,并對(duì)突變體進(jìn)行表型鑒定和功能分析。主要研究結(jié)果如下:1.利用OsU6a、TaU3和TaU6啟動(dòng)子構(gòu)建調(diào)控sgRNA表達(dá)的CRISPR/SpCas9載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)無(wú)篩選標(biāo)記材料H29中的外源GUS基因進(jìn)行編輯,發(fā)現(xiàn)TaU3調(diào)控sgRNA時(shí)的編輯效率最高（61.4%）。然后利用TaU3作為sgRNA的啟動(dòng)子,構(gòu)建包含2個(gè)串聯(lián)靶向外源GUS基因靶序列的編輯... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：165 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯（DOUDNAetal.,2014）

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文第一章緒論16體的誘導(dǎo)率，加速作物的育種進(jìn)程；對(duì)TaQ基因發(fā)生編輯的突變體植株，研究其控制穗部形態(tài)的分子機(jī)制；對(duì)TaWaxy基因發(fā)生編輯的突變體植株，研究籽粒直鏈淀粉和支鏈淀粉含量對(duì)小麥品質(zhì)的影響；對(duì)TaARG基因發(fā)生編輯的突變體植株，研究TaARG基因參與植物體內(nèi)氮代謝過(guò)程的調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果為利用CRISPR編輯技術(shù)對(duì)小麥重要內(nèi)源基因進(jìn)行高效遺傳修飾和在小麥中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的定點(diǎn)插入等研究奠定基矗另外，本研究創(chuàng)制的突變體材料對(duì)于小麥單倍體育種、高產(chǎn)育種、品質(zhì)育種和抗逆性改良等具有重要的應(yīng)用價(jià)值。1.7技術(shù)路線(xiàn)本研究首先用實(shí)驗(yàn)室之前獲得的無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因小麥株系H29（只含有外源GUS基因）為材料，比較CRISPR/SpCas9系統(tǒng)中不同sgRNA啟動(dòng)子OsU6a、TaU3和TaU6對(duì)外源GUS基因的編輯效率，篩選出sgRNA的最優(yōu)啟動(dòng)子，然后在CRISPR/SpCas9、CRISPR/Cpf1和CRISPR/xCas9系統(tǒng)中利用優(yōu)選的啟動(dòng)子構(gòu)建2個(gè)靶向外源GUS基因的串聯(lián)sgRNA，比較不同CRISPR系統(tǒng)的編輯效率。最后，利用優(yōu)化的CRISPR/SpCas9系統(tǒng)編輯小麥內(nèi)源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG，對(duì)編輯植株在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、解刨學(xué)、農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀和生物化學(xué)等層面上進(jìn)行鑒定和研究，具體技術(shù)路線(xiàn)如圖1-2所示。圖1-2本研究技術(shù)路線(xiàn)圖Fig.1-2Technologyroadmapofthisstudy

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文第二章小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效基因編輯體系建立18SYBRqPCRMasterMix購(gòu)自南京諾唯贊科技有限公司。圖2-1pWMB110載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2-1StructureofexpressionvectorpWMB1102.1.3引物序列本研究所需的xCas9序列以及各種引物序列由生工生物工程上海股份有限公司合成，各種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。所需的引物序列見(jiàn)附錄A。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1染色體原位雜交檢測(cè)參照YUAN等（2015）的方法，具體步驟如下：1.將成熟種子浸泡后放于鋪有濾紙的無(wú)菌水中，室溫放置3-4d，待主根長(zhǎng)度達(dá)2.5cm左右時(shí)，取長(zhǎng)度約1cm根尖組織，放于離心管中，并在N2O中處理2h。2.用95%的冰醋酸固定根尖5min，吸出冰醋酸，用無(wú)菌水清洗2次。3.取出根尖用濾紙吸去水分，切取根尖生長(zhǎng)點(diǎn)部位組織，放入由裂解酶、離析酶和果膠酶配置的裂解酶中，根據(jù)根尖情況在37℃水浴鍋中裂解55-58min。


本文編號(hào)：3388417