目的:本文是研究用硫代磷酸酯修飾的堿基特異性引物結(jié)合高保真聚合酶所組成的突變敏感性分子"開/關(guān)"檢測AGT基因T174M和M235T的熱點(diǎn)突變。同時將該研究方法結(jié)合目前廣泛應(yīng)用于臨床的熒光定量PCR技術(shù),其特異性強(qiáng),靈敏度高,全封閉等特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)更理想分子診斷方法。方法:從數(shù)據(jù)庫中分析AGT的SNP（single nucleotide polymophism,單核苷酸多態(tài)）結(jié)合文獻(xiàn)中AGT高頻突變位點(diǎn)T174M和M235T與妊娠高血壓的相關(guān)性。從人血液基因組中擴(kuò)增兩個突變基因的DNA片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T連接,轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建野生型載體質(zhì)粒。用一種基因工程常用的細(xì)菌重組子的篩選方法篩選出正確克隆,用pMD19-T通用引物和DNA片段對應(yīng)引物對挑選到的白色克隆用PCR方法鑒定,電泳結(jié)果中選出目標(biāo)DNA經(jīng)克隆測序以驗證是否是目標(biāo)克隆,確認(rèn)AGT基因野生型模板。采用重疊延伸PCR技術(shù),對基因多態(tài)分析位置的堿基用PCR單堿基突變,得到T174M和M235T兩個多態(tài)位點(diǎn)基因型DNA片段,定向克隆方法后的產(chǎn)物同樣用藍(lán)白斑篩選技術(shù)選出目標(biāo)條帶,這些新構(gòu)建的載體通過... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．?ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫中Ｔ１７４Ｍ基因多態(tài)性??

子水后攬拌溶解，將溶液定容至１?Ｌ后．窩溫高壓滅菌，室溫保存。??）?ＩｘＴＡＥ緩沖液的配制：稱量２０?ｍｌ的５０ＸＴＡＥ緩沖液巧加入９８０?ｍｌ的熱點(diǎn)突變多態(tài)性分析??通過ＳＮＰｓ３ｄ，ＮＣＢＩ等在線工具對ＡＧＴ基因的兩個突變基因Ｔ１７４Ｍ單核昔酸多態(tài)性分析，ＳＮＰ位點(diǎn)序號分別是（ｒｓ４７６２和ｒｓ６９９）如圖１－２??？?Ｔ１７４Ｍ??１??線３Ｃ紀(jì)＾：ＣＯｅ坂Ｃ巧ＣＴＧＣＴｅ扣ＣＡ［Ｃ／７！獻(xiàn)Ｔ說衍＾＾＾巧ｒｔＯ運(yùn)滅ＣＣ口：：Ａ??３?２３Ｇ７１?始訂??貧饋ｅ?ＡＧＴ侶㈱護(hù)／齡！??Ｆｙｎｓｉｉｏｎ如?口ｉ?ｍｉｓｓｅｌｓ安??Ｖ鑛細(xì)＃ｄ?ｂｙ的５虹￥１趙■．麵的解＊儀風(fēng)々Ｐ??獻(xiàn)含絲化ｌＡｆ?Ａ＝０?１６１敎如１９??ＨＳＶＳ?：拉。�！劬洌保目眨樱秤^巧巧０式ｆ泣（Ｗ、頗１?１１＜ｉ之巧７１安玄３１這??：泌＿護(hù)姑身記１。皆！ｆ＇滅品ｔ顧召卽３?ｅ妓離ｆ■沁＊燃齡腳１審：踰褲Ｊ了段料??圖１．?ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫中Ｔ１７４Ｍ基因多態(tài)性??Ｍ２３５Ｔ??

關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計厘疊延伸ＰＣＲ在基因的定點(diǎn)突變、融合基因的構(gòu)建、長片??段基因的合成、基因敲除Ｗ及目的基因的擴(kuò)増等方面有其廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用。??工作原理見圖３：??１）上游（引物Ａ）與基因１號鏈起始密碼子附近的序列相對應(yīng)，并在５?＇末端添加??酶切位點(diǎn)和３個保護(hù)堿基；下游（Ｂ）與基因２號鏈突變點(diǎn)附近的序列，并去除１號??基因的單堿基，實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變。??巧上游（引物Ｃ）與基因２號鏈突變點(diǎn)附近的序列對應(yīng)，實(shí)驗點(diǎn)突變。基因１號??鏈起始密碼子附近的序列相對應(yīng)，并在５＇末端添加酶切位點(diǎn)和３個保護(hù)堿基；下游（Ｄ）??與基因２號鏈末端密碼子附近的序列相對應(yīng)，并在５味端添加酶切位點(diǎn)和３個保護(hù)堿??基。??３）分別用Ａ、Ｂ擴(kuò)増出的片段ＡＢ，用Ｃ、Ｄ擴(kuò)增出的片段ＣＤ，然后再用Ａ和Ｄ??將兩基因連接起來

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]血管緊張素系統(tǒng)相關(guān)基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性研究[J]. 江美瓊,傅芬.  實(shí)用臨床醫(yī)學(xué). 2008(05)
[2]胎兒血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性與妊高征發(fā)病的關(guān)系[J]. 朱銘偉,夏燕萍,程蔚蔚,翁慧鈞,張振鈞.  中華婦產(chǎn)科雜志. 1998(10)



本文編號：3375592