殺魚愛德華氏菌（E.piscicida）是一種革蘭氏陰性、短桿狀細菌,屬腸桿菌科。廣泛分布在水生環(huán)境中,是一種條件性致病菌,可以感染多種魚類,導(dǎo)致一種稱為愛德華氏菌病的全身性疾病,并對全世界的漁業(yè)經(jīng)濟造成巨大損失。研究發(fā)現(xiàn),殺魚愛德華氏菌（E.piscicida）是一種侵入性腸道細菌,腸道中豐富的巖藻糖可以調(diào)節(jié)FusKR的雙組分系統(tǒng),促進其他基因,尤其是III型分泌系統(tǒng)（T3SS）等毒力基因的表達,對細菌的致病性具有重要作用。相關(guān)研究證實6-磷酸葡萄糖調(diào)控uhpA/uhpB雙組分系統(tǒng),并進一步調(diào)控其他毒力基因,但uhpA基因?qū)r藻糖激活FusKR相關(guān)基因和T3SS等毒力基因及其作用機制研究尚不明確。所以,擬構(gòu)建殺魚愛德華氏菌EIB202菌株的uhpA基因的缺失株ΔuhpA,通過與殺魚愛德華氏菌野毒株差異比較,研究uhpA/uhpB雙組分系統(tǒng)uhpA基因的功能。首先應(yīng)用同源重組的方法構(gòu)建了殺魚愛德華氏菌EIB202菌株的uhpA基因缺失株ΔuhpA時。通過與野生株比較發(fā)現(xiàn),6-磷酸葡萄糖顯著增加了殺魚愛德華氏菌野生株EIB202的生長速度（P<0.05）;添加6-磷酸葡萄糖作為營養(yǎng)... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

斑馬魚

圖 2 生成并鑒定了在殺魚愛德華氏菌 EIB202 中基因 uhpA 的缺失。A：uhpA 的上游（泳道 1）和下游（泳道 2）片段的 PCR 擴增；B：uhpA 的上游和下游片段的重疊 PCR；C：攜帶 pDMK-uhpA 的 SM10 的 PCR 驗證；D: pDMK-uhpA 質(zhì)粒雙酶切驗證；E：攜帶 pDMK-uhpA 的 EIB202 的PCR 驗證；F：使用引物 PW-F 和 PW-R 從 EIB202（泳道 2）或ΔuhpA（泳道 1）擴增的 PCR 產(chǎn)物。Fig.2 The deletion of gene uhpA in E. piscicida EIB202 was generated and identified.A: PCR amplication of upstream (lane 1) and downstream (lane 2) fragments of uhpA ;B: Overlap PCR of upstream anddownstream fragments of uhpA ;C: PCR verification of SM10 carrying pDMK-uhpA;D: pDMK-uhpAplasmid doubleenzyme digestion verification;E: PCR verification of EIB202 carrying pDMK-uhpA;F: PCR product amplified from EIB202(lane 1) or ΔuhpA (lane 2) using primers PW-F and PW-R.3.2 殺魚愛德華氏菌 EIB202 株與ΔuhpA 株生長曲線通過檢測殺魚愛德華氏菌 EIB202 和ΔuhpA 菌株在含有或不含 20 mM 6-磷酸葡萄糖的α-MEM 中生長。加了 6-磷酸葡萄糖作為營養(yǎng)源的野生株 EIB202 比加了 6-磷酸葡萄糖作為營養(yǎng)源的缺失株和不加 6-磷酸葡萄糖作為營養(yǎng)源的野生株和缺失株表現(xiàn)出顯著生長（P <0.05）（見圖 2）。

3 在具有和不具有 20 mM 6-磷酸葡萄糖的α-MEM 培養(yǎng)基中經(jīng)過 24 小時生長遲滯 E. piscicida EIB202 和ΔuFig.3 Growth of E. piscicida EIB202 and ΔuhpA in α-MEM medium with and without 20 mM G-6-P over 24h. 動物攻毒試驗結(jié)果.1 半數(shù)致死量（LD50）結(jié)果通過一周的觀察，對照組全部存活，試驗組存活情況見表 7 與表 8。按照 Reed-Muench 方法計算可得，野生株的 LD50值 1×105CFU/fish，突變株 uhp50值為 2×104CFU/fish。對照組在試驗過程中沒有死亡現(xiàn)象。表 6 EIB202 組存活情況統(tǒng)計Table6 Survival statistics of group EIB202釋度 感染數(shù) 存活數(shù) 死亡數(shù) 累計總數(shù) 死亡比（死亡總數(shù)/總數(shù)）死亡率存活數(shù) 死亡數(shù)10010 0 10 0 18 18/18 100-110 4 6 4 8 8/12 66

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]殺魚愛德華氏菌中Fur和EsrB對其生理和代謝的調(diào)控機制[D]. 趙路遙.華東理工大學(xué) 2017
[2]遲緩愛德華菌弱毒株的分離鑒定及對羅非魚的免疫保護效果研究[D]. 龐曉茹.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]遲鈍愛德華氏菌活性氧抗性、雙組分系統(tǒng)QseEF及三型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的功能鑒定[D]. 陳濤.華東理工大學(xué) 2011



本文編號：3367437