目的膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（SREBPs）是調(diào)控脂類代謝的重要轉錄因子,其與代謝性疾病密切相關。V-ATPase作為持家基因,通過全酶的聚集和解離調(diào)節(jié)酶的活性。目前尚未有關于V-ATPase及其所在通路調(diào)控SREBP的相關報道。方法構建基因重組質(zhì)粒,PCR法擴增V-ATPase基因片段,并將其插入表達載體pcDNA3.1質(zhì)粒,構建基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1-V-ATPase,將目的質(zhì)粒pcDNA3.1-V-ATPase及對照質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉染大鼠腎小球系膜細胞。采用WesternBlotting、q-PCR、熒光顯微觀察等方法研究V-ATPase和SREBPs的關系。結果發(fā)現(xiàn)V-ATPase功能缺失抑制大鼠腎小球系膜細胞脂肪積累,V-ATPase調(diào)控SREBP的功能具有保守性,V-ATPase調(diào)控SREBP-1的入核不依賴于泛素化降解,V-ATPase調(diào)控SREBP-1的核積累依賴于溶酶體的pH值。結論上述結果說明V-ATPase是新的調(diào)控SBP-1的基因。這為尋找新的調(diào)控SREBP的因子,并研究其調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用機制提供了依據(jù)。 

【文章來源】：解剖學研究. 2020,42(05)

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【部分圖文】：

氣相色譜檢測脂肪酸成分的變化

通過二甲基亞砜（DMSO）和V-ATPase特異性抑制劑（Bafilomycin A1）做比較可得出如下內(nèi)容：SREBP、V-ATPase組織及布局一般認為不易變化，通過應用Bafilomycin A1作用于大鼠腎小球系膜細胞，經(jīng)過Western blot和Filipin染色檢驗SREBP相關p SREBP及n SREBP中成分的量和細胞脂肪成分的變動。應用BafilomycinA1后，促使SREBP更多地集結于胞核。含量較少的BafilomycinA1使SREBP增多；BafilomycinA1使SREBP明顯降低。SREBP、V-ATPase組織及布局不易變化的觀點得以證實，由實驗可知，膽固醇的位置發(fā)生明顯改變，這是V-ATPase調(diào)控其運輸?shù)慕Y果。由于胞內(nèi)體的酸化受阻，導致受體無法與配體分離，因此受體和配體以及細胞膜上的膽固醇被同時阻斷在細胞質(zhì)中（圖3）。2.4 V-ATPase調(diào)控SREBP-1的入核不依賴于泛素化降解，依賴于溶解酶體的PH值

SREBP-1在核內(nèi)的聚集。由于核內(nèi)的SREBP-1降解途徑是依賴于泛素化-蛋白酶體體系的，所以為了檢測是不是由于SREBP-1的降解出現(xiàn)了問題進而導致其核內(nèi)的積累，我們用V-ATPase另一種特異性抑制劑（MG132）和BafilomycinA1分別抑制蛋白酶體和V-ATPase的活性，結果顯示：當MG132存在時，加入BafilomycinA1仍然能夠促進SREBP-1在細胞核內(nèi)聚集，而且二者導致的nSREBP-1增加具有疊加效應。V-ATPase和溶酶體、高爾基體中p H值的穩(wěn)定密切相關，溶酶體pH值小于7的狀態(tài)為維續(xù)細胞正常功能的根本，V-ATPase活性降低和溶酶體的酸性環(huán)境的維持以及甘油三酯及膽固醇運送密切相關。通過正丙胺的作用抑制溶酶體的酸性內(nèi)環(huán)境，可知，V-ATPas節(jié)制SREBP-1和溶酶體的pH值的穩(wěn)定密切相關（圖4）。3 討論


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