利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制備了SST基因敲除的細胞。在豬SST基因第一外顯子區(qū)域設計2個向?qū)NA （sgRNA）,用PX459構(gòu)建成表達質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)染豬胎兒的成纖維細胞,在48 h后用嘌呤霉素篩選細胞。通過PCR擴增、測序檢測,在獲得的13個克隆中,有2株細胞未檢測到基因敲除,4株細胞發(fā)生單等位基因敲除,7株細胞為雙等位基因刪除。篩選到的純合子單克隆細胞可用于制備SST基因刪除豬。 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)學報. 2020,32(08)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

質(zhì)粒構(gòu)建信息圖

經(jīng)過7 d左右的培養(yǎng),當成纖維細胞在組織塊周圍長成片并且匯合度逐漸達到90%時,將組織塊挑去可獲得原代細胞。腎成纖維細胞生長狀態(tài)較好,呈梭形,在顯微鏡下觀察,其細胞透明,邊緣清晰(圖2)。在傳代后生長迅速,2～3 d即可長滿6孔板。轉(zhuǎn)染前1 d消化細胞傳代后,轉(zhuǎn)染時細胞即處于對數(shù)生長期,活力最好,轉(zhuǎn)染效果最佳。2.2 質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果

將E1-1、E1-2分別與線性化的PX459質(zhì)粒鏈接,然后用限制性內(nèi)切酶驗證打靶質(zhì)粒。設計用KPnⅠ+ApaⅠ雙酶切,酶切后兩條帶大小分別為2288和6886 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)顯示片段大小與預期一致,只是質(zhì)粒濃度較高,部分未酶切。將酶切驗證后的質(zhì)粒擴繁,提取菌液的質(zhì)粒,經(jīng)過公司測序,測序結(jié)構(gòu)如圖3所示,sgRNA插入的方向、位置與預期相符,質(zhì)粒構(gòu)建成功。

【參考文獻】：
期刊論文
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