利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制備了SST基因敲除的細(xì)胞。在豬SST基因第一外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)2個(gè)向?qū)NA （sgRNA）,用PX459構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)染豬胎兒的成纖維細(xì)胞,在48 h后用嘌呤霉素篩選細(xì)胞。通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序檢測(cè),在獲得的13個(gè)克隆中,有2株細(xì)胞未檢測(cè)到基因敲除,4株細(xì)胞發(fā)生單等位基因敲除,7株細(xì)胞為雙等位基因刪除。篩選到的純合子單克隆細(xì)胞可用于制備SST基因刪除豬。 

【文章來(lái)源】：江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2020,32(08)

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

質(zhì)粒構(gòu)建信息圖

經(jīng)過(guò)7 d左右的培養(yǎng),當(dāng)成纖維細(xì)胞在組織塊周?chē)L(zhǎng)成片并且匯合度逐漸達(dá)到90%時(shí),將組織塊挑去可獲得原代細(xì)胞。腎成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好,呈梭形,在顯微鏡下觀察,其細(xì)胞透明,邊緣清晰(圖2)。在傳代后生長(zhǎng)迅速,2～3 d即可長(zhǎng)滿(mǎn)6孔板。轉(zhuǎn)染前1 d消化細(xì)胞傳代后,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,活力最好,轉(zhuǎn)染效果最佳。2.2 質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果

將E1-1、E1-2分別與線性化的PX459質(zhì)粒鏈接,然后用限制性?xún)?nèi)切酶驗(yàn)證打靶質(zhì)粒。設(shè)計(jì)用KPnⅠ+ApaⅠ雙酶切,酶切后兩條帶大小分別為2288和6886 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)顯示片段大小與預(yù)期一致,只是質(zhì)粒濃度較高,部分未酶切。將酶切驗(yàn)證后的質(zhì)粒擴(kuò)繁,提取菌液的質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)構(gòu)如圖3所示,sgRNA插入的方向、位置與預(yù)期相符,質(zhì)粒構(gòu)建成功。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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