抗凍蛋白基因（Antifreeze protein,AFP）是當(dāng)前昆蟲抗寒性研究中的熱門候選基因。該基因能夠非依數(shù)性地降低昆蟲血淋巴冰點(diǎn)而對熔點(diǎn)無顯著影響,進(jìn)而提高昆蟲對低溫環(huán)境的適應(yīng)性以及存活率。迄今為止,關(guān)于膜翅目昆蟲抗凍蛋白表達(dá)特性及蜜蜂個(gè)體抗寒機(jī)制的研究未見報(bào)道。本研究通過對不同溫度處理后的中蜂工蜂個(gè)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,從而探究蜜蜂體內(nèi)抗寒相關(guān)的候選基因。對25℃、10℃和0℃處理后中蜂和意蜂體內(nèi)葡萄糖、甘油以及氨基酸含量進(jìn)行測定,從而探究與蜜蜂抗寒相關(guān)的生理指標(biāo)。利用基因克隆獲得中蜂和意蜂AFP基因序列,并利用熒光定量PCR技術(shù)檢測兩蜂種不同發(fā)育時(shí)期、不同組織以及不同性別中AFP mRNA的表達(dá)差異。利用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)測定兩蜂種在不同低溫脅迫處理下AFP的表達(dá)量,將其表達(dá)量與同處理下各抗凍保護(hù)劑的濃度進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過體外飼喂dsRNA的方法對中蜂和意蜂體內(nèi)AFP基因進(jìn)行RNA沉默,檢測沉默前后兩蜂種體內(nèi)其他抗寒相關(guān)蛋白基因的變化。通過差示熱力掃描儀對中蜂AFP基因RNAi前后血淋巴液的熱滯活性進(jìn)行測定,結(jié)合原核表達(dá)所得中蜂抗凍蛋白的熱滯活性檢測結(jié)... 

【文章來源】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：133 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１蜜蜂ｄＦＰ基因的差異表達(dá)及個(gè)體抗寒機(jī)制研究的技術(shù)路線圖??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｈｅ??

Ｎｏｔｅ：?Ａ，?Ｔｈｅ?ｔｏｔａｌ?ｆｒｅｅｚｅ?ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｆ?ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ?ｏｆ．＾．?ｃ．?ｃｅｒａｎａ．?Ｂ，?Ｔｈｅ?ｔｏｔａｌ?ｆｒｅｅｚｅ?ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｆ??ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ?ｏｆ?ｍ．?ｌｉｇｕｓｔｉｃａ．??通過差示熱力掃描儀ＤＳＣ測定中蜂和意蜂血淋巴液的完全結(jié)冰溫度，結(jié)果見圖３－１。??由圖可知，中蜂血淋巴液的完全結(jié)冰溫度為－９．４６°Ｃ，而意蜂血淋巴的完全結(jié)冰溫度為??－７．３８°Ｃ，中蜂血淋巴液的完全結(jié)冰溫度較意蜂低２．０８°Ｃ。??２．２低溫脅迫下蜜蜂體內(nèi)葡萄糖含量的變化??中蜂和意蜂不同溫度處理后體內(nèi)葡萄糖含量見圖３－２。由圖可知，中蜂和意蜂不同??溫度處理后體內(nèi)葡萄糖含量存在顯著的變化（尸＜０．０５），且不同蜂種間存在一定差異。??在中蜂體內(nèi)，２５°Ｃ處理組的葡萄糖含量最高，０°Ｃ組次之，丨０°Ｃ組的含量最低，且丨０°Ｃ??組葡萄糖含量顯著低于２５°Ｃ組和０°Ｃ組（Ｐ＜０．０５）。在意蜂體內(nèi)，１０°Ｃ組的葡萄糖含量??最高，顯著高于２５°Ｃ組和０°Ｃ組（Ｐ＜０．０５），同時(shí)，２５°Ｃ處理組的葡萄糖含量顯著高于??０°Ｃ組（Ｐ＜０．０５）。通過比較兩蜂種在不同處理時(shí)的葡萄糖含量可發(fā)現(xiàn)

２．３低溫脅迫下蜜蜂體內(nèi)甘油含量的變化??２．３．１甘油含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制??甘油含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制見圖３－３。由圖可知，２倍稀釋的標(biāo)品的ＯＤ值的變化??基本呈線性關(guān)系，經(jīng)過計(jì)算可得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為ｙ＝０．２９４２ｘ－０．０３３７，?Ｒ２值為０．９９９２。??表明本試驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線可信程度較高，可用于下一步甘油含量的測定。??°－３?ｖ?＝?０．２９４２?ｘ?－?０．０３３７??０．２５?＇?Ｒ：?＝?０．９９９２?．．．．．．??０．２?．．？？？？？??？?？？??０．１５?？？？？？？？??０．１?？？？？？．??°＊０５?？？＃？？？’??〇——＾???０?０．２?０．４?０．６?０．８?１?１．２??圖３－３甘油含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇ．?３－３?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｆｏｒ?ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇｌｙｃｅｒｉｎｕｍ??－４０－??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3362877