肌醇半乳糖苷合成酶（GolS）是棉子糖系列寡糖（RFOs）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過RT-PCR從大豆葉片cDNA中擴(kuò)增獲得編碼GolS的GmGolS2-1和GmGolS2-3基因。添加酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和SalⅠ,將GmGolS2-1和GmGolS2-3分別連入原核表達(dá)載體pET28中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明:在誘導(dǎo)時間為3h,IPTG濃度為0.1mmol·L^-1時,可獲得大量GmGolS2-1和GmGolS2-3的重組蛋白,分子量均大約為40kD。 

【文章來源】：黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020,(08)

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【部分圖文】：

GmGolS2-1和GmGolS2-3PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒雙酶切

為了獲得GmGolS2-1和GmGolS2-3的原核表達(dá)蛋白，對IPTG的濃度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行了優(yōu)化。圖3是GmGolS2-1的IPTG不同誘導(dǎo)時間結(jié)果，3-8號泳道與對照（孔道1為空載體、孔道2為未誘導(dǎo)菌體）相比，在大概40kD處有目的蛋白的表達(dá)。圖4是GmGolS2-3的IPTG不同誘導(dǎo)時間結(jié)果，3-8號泳道與對照（孔道1為空載體、孔道2為未誘導(dǎo)菌體）相比，在大概40kD處有目的蛋白的表達(dá)。GmGolS2-1和GmGolS2-3蛋白分子量大小分別為38.05和38.1kD，加上組氨酸標(biāo)簽之后的融合蛋白大小均約為40kD，因此表達(dá)的蛋白大小均與預(yù)期結(jié)果相符，且在對照中均無此蛋白的表達(dá)。表明GmGolS2-1和GmGolS2-3基因已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達(dá)。如圖3和圖4所示，在IPTG誘導(dǎo)1h時均已出現(xiàn)重組蛋白，隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組蛋白的表達(dá)量隨之增加，到3h時GmGolS2-1和GmGolS2-3的表達(dá)量均達(dá)到最大值，之后差別不大。所以后續(xù)試驗(yàn)IPTG的誘導(dǎo)時間均設(shè)為3h。圖3 GmGolS2-1原核表達(dá)誘導(dǎo)時間優(yōu)化

GmGolS2-1原核表達(dá)誘導(dǎo)時間優(yōu)化

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號：3358077