林木是一種重要的可再生資源,在保護(hù)環(huán)境和維持環(huán)境平衡方面發(fā)揮著重要作用。楊樹(shù)是我國(guó)乃至全世界種植面積最廣,適應(yīng)性最強(qiáng)的樹(shù)種之一。然而,在溫度極低的東北地區(qū),楊樹(shù)的受凍情況依然嚴(yán)重。為了更好地推廣楊樹(shù)的應(yīng)用,拓寬楊樹(shù)的適用范圍,楊樹(shù)的抗寒脅迫育種工作,也逐漸成為目前育種工作的重要內(nèi)容。針對(duì)以往楊樹(shù)存在的抗寒性問(wèn)題,運(yùn)用生物分子技術(shù)發(fā)現(xiàn)與抗寒性相關(guān)的基因,并利用基因工程技術(shù)培育楊樹(shù)抗寒新品種,將會(huì)為林業(yè)及全球環(huán)境問(wèn)題帶來(lái)巨大的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本研究利用南極擬三列真蘚（Antarctic Bryum pseudothique）中與植物抗寒性相關(guān)的BpMBF1轉(zhuǎn)錄因子,采用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化到窄冠白楊1號(hào)（Populus leucopyrami-dalis 1,L1）中。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒別,檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株提取RNA進(jìn)行表達(dá)量鑒定,選取表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行低溫脅迫,測(cè)定其抗寒性生理生化指標(biāo),驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系的抗寒性。為進(jìn)一步探究該基因在楊樹(shù)中的功能,利用新一代Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)該轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照組植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果,尋找差異表達(dá)基因,并對(duì)這些差異... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

低溫脅迫下植物的響應(yīng)(MiuraK,2013)

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文9ER24(ethyleneresponsivetranscriptionalco-activators)(Zegzoutietal.,1999)。在模式植物擬南芥中編碼MBF1蛋白的有三個(gè)不同的基因，分別是AtMBF1a，AtMBF1b和AtMBF1c。其中AtMBFla定位在II號(hào)染色體上，AtMBF1b和AtMBF1c定位在III號(hào)染色體上。AtMBF1a和AtMBF1b擁有相似的基因結(jié)構(gòu)，包括四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子，但AtMBF1c沒(méi)有內(nèi)含子（圖2）(TsudaandYamazaki,2004）。圖2擬南芥AtMBF1基因的染色體位置，外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(TsudaandYamazaki,2004）Fig2Chromosomallocationsandexon/intronstructuresofAtMBF1genes(TsudaandYamazaki,2004）Tsuda和Yamazaki等將AtMBF1c基因與GUS融合進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植株在受到高溫、過(guò)氧化物、脫水、高鹽等逆境脅迫時(shí)該融合基因的表達(dá)將會(huì)被上調(diào)(TsudaandYamazaki,2004）。Arce等在對(duì)這三個(gè)基因的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)植株受逆境脅迫時(shí)MBF1基因是作為乙烯、ABA以及逆境因子間溝通的橋梁而出現(xiàn)的，通過(guò)調(diào)節(jié)作為ABA抑制劑的ABR1表達(dá)而間接發(fā)揮功能（Arceetal.,2010)。Matsushita等在研究與MBF1類似的基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用乙烯類化合物噴灑西紅柿，該基因表達(dá)被相應(yīng)上調(diào)。據(jù)此，他們認(rèn)為該類基因不僅參與到了植物的生理活動(dòng)中，同時(shí)在植物抵御外界不良條件干擾的過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用（Matsushitaetal.,2002）。當(dāng)土豆受到外部損傷、真菌侵害、乙烯利以及水楊酸等外源激素處理時(shí)，其StMBF1基因發(fā)生響應(yīng)上調(diào)表達(dá)。Godoy（2001）等認(rèn)為StMBF1基因的功能便是在植物受到外界脅迫反應(yīng)時(shí)，盡量削弱這種脅迫帶來(lái)的

BpMBF1轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)窄冠白楊1號(hào)的抗寒性功能驗(yàn)證20EB緩沖液沖洗。純化后，對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行最后的修復(fù)，堿基A和銜接子進(jìn)行測(cè)序，然后利用瓊脂糖凝膠電泳回收的目標(biāo)片段，并通過(guò)PCR擴(kuò)增，以完成cDNA文庫(kù)的完整制備。文庫(kù)構(gòu)建成功后，首先使用Qubit3.0進(jìn)行起始的定量，將文庫(kù)稀釋至1ng/ul，然后使用Agilent2100檢測(cè)文庫(kù)插入片段的大校插入片段大小達(dá)到預(yù)期后，使用Bio-RADCFX96.熒光定量法，使用PCR儀Bio-RADKITiQSYBRGRN進(jìn)行Q-PCR，以確保庫(kù)的質(zhì)量。使用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序策略為PE150。其實(shí)驗(yàn)流程如下：圖3實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.3Flowchartoftest2.2.4.3信息分析流程通過(guò)在Illumina平臺(tái)上測(cè)序獲得的未處理讀數(shù)，通過(guò)消除低質(zhì)量序列和去污染以獲得高質(zhì)量序列的過(guò)程來(lái)完成數(shù)據(jù)處理（CleanReads）。使用CleanReads，比較所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析。AnuoYouda使用的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息分析過(guò)程分為三個(gè)部分：測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，數(shù)據(jù)比較分析和轉(zhuǎn)錄組的深入分析。其中，測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制包括過(guò)濾獲得的序列，評(píng)估序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量以及計(jì)算序列長(zhǎng)


本文編號(hào)：3350820