林木是一種重要的可再生資源,在保護環(huán)境和維持環(huán)境平衡方面發(fā)揮著重要作用。楊樹是我國乃至全世界種植面積最廣,適應(yīng)性最強的樹種之一。然而,在溫度極低的東北地區(qū),楊樹的受凍情況依然嚴(yán)重。為了更好地推廣楊樹的應(yīng)用,拓寬楊樹的適用范圍,楊樹的抗寒脅迫育種工作,也逐漸成為目前育種工作的重要內(nèi)容。針對以往楊樹存在的抗寒性問題,運用生物分子技術(shù)發(fā)現(xiàn)與抗寒性相關(guān)的基因,并利用基因工程技術(shù)培育楊樹抗寒新品種,將會為林業(yè)及全球環(huán)境問題帶來巨大的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益。本研究利用南極擬三列真蘚（Antarctic Bryum pseudothique）中與植物抗寒性相關(guān)的BpMBF1轉(zhuǎn)錄因子,采用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化到窄冠白楊1號（Populus leucopyrami-dalis 1,L1）中。對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR鑒別,檢測陽性的轉(zhuǎn)基因植株提取RNA進行表達量鑒定,選取表達量高的轉(zhuǎn)基因植株進行低溫脅迫,測定其抗寒性生理生化指標(biāo),驗證轉(zhuǎn)基因株系的抗寒性。為進一步探究該基因在楊樹中的功能,利用新一代Illumina高通量測序技術(shù)對該轉(zhuǎn)基因植株和對照組植株進行轉(zhuǎn)錄組測序,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果,尋找差異表達基因,并對這些差異... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

低溫脅迫下植物的響應(yīng)(MiuraK,2013)

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文9ER24(ethyleneresponsivetranscriptionalco-activators)(Zegzoutietal.,1999)。在模式植物擬南芥中編碼MBF1蛋白的有三個不同的基因，分別是AtMBF1a，AtMBF1b和AtMBF1c。其中AtMBFla定位在II號染色體上，AtMBF1b和AtMBF1c定位在III號染色體上。AtMBF1a和AtMBF1b擁有相似的基因結(jié)構(gòu)，包括四個外顯子和三個內(nèi)含子，但AtMBF1c沒有內(nèi)含子（圖2）(TsudaandYamazaki,2004）。圖2擬南芥AtMBF1基因的染色體位置，外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(TsudaandYamazaki,2004）Fig2Chromosomallocationsandexon/intronstructuresofAtMBF1genes(TsudaandYamazaki,2004）Tsuda和Yamazaki等將AtMBF1c基因與GUS融合進行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植株在受到高溫、過氧化物、脫水、高鹽等逆境脅迫時該融合基因的表達將會被上調(diào)(TsudaandYamazaki,2004）。Arce等在對這三個基因的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)植株受逆境脅迫時MBF1基因是作為乙烯、ABA以及逆境因子間溝通的橋梁而出現(xiàn)的，通過調(diào)節(jié)作為ABA抑制劑的ABR1表達而間接發(fā)揮功能（Arceetal.,2010)。Matsushita等在研究與MBF1類似的基因功能時發(fā)現(xiàn)，利用乙烯類化合物噴灑西紅柿，該基因表達被相應(yīng)上調(diào)。據(jù)此，他們認(rèn)為該類基因不僅參與到了植物的生理活動中，同時在植物抵御外界不良條件干擾的過程中也發(fā)揮了重要的作用（Matsushitaetal.,2002）。當(dāng)土豆受到外部損傷、真菌侵害、乙烯利以及水楊酸等外源激素處理時，其StMBF1基因發(fā)生響應(yīng)上調(diào)表達。Godoy（2001）等認(rèn)為StMBF1基因的功能便是在植物受到外界脅迫反應(yīng)時，盡量削弱這種脅迫帶來的

BpMBF1轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)窄冠白楊1號的抗寒性功能驗證20EB緩沖液沖洗。純化后，對雙鏈cDNA進行最后的修復(fù)，堿基A和銜接子進行測序，然后利用瓊脂糖凝膠電泳回收的目標(biāo)片段，并通過PCR擴增，以完成cDNA文庫的完整制備。文庫構(gòu)建成功后，首先使用Qubit3.0進行起始的定量，將文庫稀釋至1ng/ul，然后使用Agilent2100檢測文庫插入片段的大校插入片段大小達到預(yù)期后，使用Bio-RADCFX96.熒光定量法，使用PCR儀Bio-RADKITiQSYBRGRN進行Q-PCR，以確保庫的質(zhì)量。使用Illumina高通量測序技術(shù)對檢測合格的文庫進行測序。測序策略為PE150。其實驗流程如下：圖3實驗流程圖Fig.3Flowchartoftest2.2.4.3信息分析流程通過在Illumina平臺上測序獲得的未處理讀數(shù)，通過消除低質(zhì)量序列和去污染以獲得高質(zhì)量序列的過程來完成數(shù)據(jù)處理（CleanReads）。使用CleanReads，比較所有后續(xù)實驗數(shù)據(jù)并分析。AnuoYouda使用的轉(zhuǎn)錄組測序信息分析過程分為三個部分：測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，數(shù)據(jù)比較分析和轉(zhuǎn)錄組的深入分析。其中，測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制包括過濾獲得的序列，評估序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量以及計算序列長


本文編號：3350820