基于CRISPR/Cas9技術的煙草NtDXR基因敲除及功能分析
發(fā)布時間：2021-08-17 19:04
為研究煙草5-磷酸脫氧木酮糖還原異構酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR）基因的表達模式和功能,從普通煙草（Nicotiana tabacum）品種紅花大金元中克隆了NtDXR基因,并通過熒光定量PCR技術分析了NtDXR在紅花大金元不同發(fā)育時期、不同組織中的表達模式。同時利用CRISPR/Cas9技術構建了NtDXR敲除載體,獲得了DXR基因突變的植株。結果表明:NtDXR基因在花中的表達量最高,在雌蕊和葉中次之;利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點敲除NtDXR基因后,檢測目的基因靶位點序列發(fā)現有堿基的插入、缺失與置換,并且部分T0代轉基因陽性植株呈現白化表型,暗示NtDXR基因在煙草葉綠素等色素合成過程中起重要作用,推測NtDXR基因的突變能阻斷煙草質體色素的合成。
【文章來源】：中國煙草學會2016年度優(yōu)秀論文匯編——煙草農業(yè)主題中國煙草學會專題資料匯編
【文章頁數】：7 頁
【部分圖文】：
刀理DXR序列比對結果
2016煙草科技年長度為1500bp左右的片段（圖1）。將測序結果與紅大基因組數據庫中的序列進行比對，結果（圖2）表明，該序列與基因組數據庫中DXR基因的mRNA序列相似度為99%，所得目的片段為NtDXR基因序列。2.2NtDXR基因表達模式分析提取普通煙草紅大不同時期、不同組織的總RNA，反轉錄成cDNA后，用NtGAPDH基因檢測cDNA質量。電泳結果（圖3）表明，cDNA質量滿足后續(xù)實驗要求。熒光定量PCR結果（圖4）表明，NtDXR在不同組織中的表達量各有不同，在花、葉、雌蕊中的表達量較高，莖尖次之，根、莖、雄蕊中表達量較低。M.Trans2KDNAMarker1.NtDXR基因片段圖1NtDXRPCR擴增電泳圖Fig.1ElectrophoretogramofNtDXRPCRamplificationNtDXR.本實驗中克隆的序列DXR.煙草基因組數據庫中的序列圖2NtDXR序列比對結果Fig.2SequencealignmentofNtDXRM.Trans2KDNAMarker1~10.依次為大十字期根、大十字期莖、大十字期葉、大十字期莖尖、成熟期根、成熟期莖、成熟期葉、花、雌蕊、雄蕊圖3cDNA質量檢測圖Fig.3ElectrophoretogramofcDNA圖4NtDXR基因在煙草不同發(fā)育時期、不同組織中的表達Fig.4SpatialandtemporalexpressionpatternsofNtDXR·4·
第49卷第6期2.3NtDXR基因敲除載體構建菌落PCR擴增出500bp左右大小的片段（圖5a），表明菌落可能為陽性克攏將菌液送至北京華大基因科技股份有限公司測序，結果（圖5b）顯示插入目的片段中含有靶位點20bp的核苷酸序列，表明靶位點已成功插入到pORE-Cas9/gRNA載體中，即敲除載體構建成功（圖5c）。2.4NtDXR轉基因煙株的檢測通過構建CRISPR/Cas9敲除載體及運用農桿菌介導的植物轉化技術，獲得了具有抗卡那霉素的T0代陽性轉化苗。提取陽性煙苗葉片基因組DNA進行PCR擴增，以檢測外源插入DNA片段。電泳結果（圖6）表明，擴增的目的片段大小為390bp，與引物設計擴增序列的大小一致，初步表明在抗性培養(yǎng)基上生長的煙苗基因組內均插入敲除載體序列，即NtDXR敲除載體已成功轉入到煙草植株中。2.5T0代轉基因煙草表型觀察及驗證陽性轉基因組培幼苗大部分植株呈綠色（圖7a），與正常煙草組培苗表型無差異。在T0代陽性轉化苗中，發(fā)現4株與其他陽性轉化苗表型完全不同的植株，表現為白化表型（圖7b）。以陽性轉基因煙苗基因組DNA為模板，用DXR-jiance-F和DXR-jiance-R引物擴增含有NtDXR基因的靶位點片段，共檢測4株白化苗和15株綠色苗中NtDXR基因序列的突變形式，并對不同突變形式出現的概率進行統(tǒng)計。結果（表1、圖8）表明，在4株白化苗中，所測得的NtDXR基因靶位點序列均出現不同形式的突變，包括堿基的插入、缺失，但并沒有檢測到與野生型煙草NtDXR相一致的序列。4株白化苗NtDXR基因靶位點序列有3種突變形式，第一種是在靶位點附近增加1個堿基T或A；第二種是在靶位點附近丟失7個堿基；第三種是在靶位點附近丟失1個堿基T。這3種突變形式均能導致NtDXR蛋白翻譯錯誤，從而使蛋白喪失功能。在15株轉基因綠色苗中，只有3株煙?
【參考文獻】：
期刊論文
[1]煙草5-磷酸脫氧木酮糖還原異構酶基因（dxr）的克隆和表達分析[J]. 朱曉宇,王景,趙二衛(wèi),姚姍姍,崔紅. 農業(yè)生物技術學報. 2011(02)
[2]植物次生代謝與煙草香味物質[J]. 楊鐵釗,李欽奎,李偉. 中國煙草科學. 2005(04)
[3]類萜代謝工程研究進展及在煙草品種改良中的應用前景[J]. 崔紅,宋志紅. 中國煙草學報. 2003(02)
本文編號：3348323
【文章來源】：中國煙草學會2016年度優(yōu)秀論文匯編——煙草農業(yè)主題中國煙草學會專題資料匯編
【文章頁數】：7 頁
【部分圖文】：
刀理DXR序列比對結果
2016煙草科技年長度為1500bp左右的片段（圖1）。將測序結果與紅大基因組數據庫中的序列進行比對，結果（圖2）表明，該序列與基因組數據庫中DXR基因的mRNA序列相似度為99%，所得目的片段為NtDXR基因序列。2.2NtDXR基因表達模式分析提取普通煙草紅大不同時期、不同組織的總RNA，反轉錄成cDNA后，用NtGAPDH基因檢測cDNA質量。電泳結果（圖3）表明，cDNA質量滿足后續(xù)實驗要求。熒光定量PCR結果（圖4）表明，NtDXR在不同組織中的表達量各有不同，在花、葉、雌蕊中的表達量較高，莖尖次之，根、莖、雄蕊中表達量較低。M.Trans2KDNAMarker1.NtDXR基因片段圖1NtDXRPCR擴增電泳圖Fig.1ElectrophoretogramofNtDXRPCRamplificationNtDXR.本實驗中克隆的序列DXR.煙草基因組數據庫中的序列圖2NtDXR序列比對結果Fig.2SequencealignmentofNtDXRM.Trans2KDNAMarker1~10.依次為大十字期根、大十字期莖、大十字期葉、大十字期莖尖、成熟期根、成熟期莖、成熟期葉、花、雌蕊、雄蕊圖3cDNA質量檢測圖Fig.3ElectrophoretogramofcDNA圖4NtDXR基因在煙草不同發(fā)育時期、不同組織中的表達Fig.4SpatialandtemporalexpressionpatternsofNtDXR·4·
第49卷第6期2.3NtDXR基因敲除載體構建菌落PCR擴增出500bp左右大小的片段（圖5a），表明菌落可能為陽性克攏將菌液送至北京華大基因科技股份有限公司測序，結果（圖5b）顯示插入目的片段中含有靶位點20bp的核苷酸序列，表明靶位點已成功插入到pORE-Cas9/gRNA載體中，即敲除載體構建成功（圖5c）。2.4NtDXR轉基因煙株的檢測通過構建CRISPR/Cas9敲除載體及運用農桿菌介導的植物轉化技術，獲得了具有抗卡那霉素的T0代陽性轉化苗。提取陽性煙苗葉片基因組DNA進行PCR擴增，以檢測外源插入DNA片段。電泳結果（圖6）表明，擴增的目的片段大小為390bp，與引物設計擴增序列的大小一致，初步表明在抗性培養(yǎng)基上生長的煙苗基因組內均插入敲除載體序列，即NtDXR敲除載體已成功轉入到煙草植株中。2.5T0代轉基因煙草表型觀察及驗證陽性轉基因組培幼苗大部分植株呈綠色（圖7a），與正常煙草組培苗表型無差異。在T0代陽性轉化苗中，發(fā)現4株與其他陽性轉化苗表型完全不同的植株，表現為白化表型（圖7b）。以陽性轉基因煙苗基因組DNA為模板，用DXR-jiance-F和DXR-jiance-R引物擴增含有NtDXR基因的靶位點片段，共檢測4株白化苗和15株綠色苗中NtDXR基因序列的突變形式，并對不同突變形式出現的概率進行統(tǒng)計。結果（表1、圖8）表明，在4株白化苗中，所測得的NtDXR基因靶位點序列均出現不同形式的突變，包括堿基的插入、缺失，但并沒有檢測到與野生型煙草NtDXR相一致的序列。4株白化苗NtDXR基因靶位點序列有3種突變形式，第一種是在靶位點附近增加1個堿基T或A；第二種是在靶位點附近丟失7個堿基；第三種是在靶位點附近丟失1個堿基T。這3種突變形式均能導致NtDXR蛋白翻譯錯誤，從而使蛋白喪失功能。在15株轉基因綠色苗中，只有3株煙?
【參考文獻】：
期刊論文
[1]煙草5-磷酸脫氧木酮糖還原異構酶基因（dxr）的克隆和表達分析[J]. 朱曉宇,王景,趙二衛(wèi),姚姍姍,崔紅. 農業(yè)生物技術學報. 2011(02)
[2]植物次生代謝與煙草香味物質[J]. 楊鐵釗,李欽奎,李偉. 中國煙草科學. 2005(04)
[3]類萜代謝工程研究進展及在煙草品種改良中的應用前景[J]. 崔紅,宋志紅. 中國煙草學報. 2003(02)
本文編號：3348323
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