天然產(chǎn)物（Natural Products,NPs）是藥物先導(dǎo)化合物及臨床藥物的重要來源,其中微生物來源的NPs占比高達(dá)1/3。微生物藥物發(fā)現(xiàn)在上世紀(jì)六十年代前后,經(jīng)歷黃金期后,最近幾十年卻幾乎進(jìn)入停滯狀態(tài),人們一度認(rèn)為微生物藥物資源已經(jīng)枯竭。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,微生物全基因組被不斷揭秘,海量暗物質(zhì)樣沉默基因簇（Biosynthetic Gene Cluster,BGC）被發(fā)現(xiàn)。這些暗物質(zhì)蘊(yùn)藏了大量的新穎生物活性小分子（Bioactive Small Molecules,BSMs）。通過異源表達(dá)激活沉默BGC是獲得這些BSMs的主要手段。但克隆獲取這些BGC大片段通常比較困難。放線菌作為微生物藥物合成的主力,由于其基因組GC含量高的特性,從中直接克隆大片段DNA（≥80kb）目前依舊缺乏簡單高效的方法。本研究開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a的簡單、快速、直接克隆大片段DNA的體外技術(shù)平臺,稱為CAT-FISHING（CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosynthetic gene clustercloning platfo... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

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華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文?第７頁??ｇｅｎｅ?ｃｌｕｓｔｅｒ?ｏｆ?ｉｎｔｅｒｅｓｔ??？…ｉ…ｒ、??Ｓ．?ｃｅｒｓｖｉｓｔｓｅ??ｓ叫，?產(chǎn)、?????Ｓ．?ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ??Ｓｔｅｐ?２??■葉?＂?〇ｒ??ｏ’??Ｓｔｅｐ３．．．－?）??＾?ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｓ??ｊ?＞Ｍ＞？ｉ?＂，■／??圖１－４轉(zhuǎn)化相關(guān)重組克隆技術(shù)（ＴＡＲ）的三步流程Ｗ??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ?ｆｏｒ?ＴＡＲ－ｈａｓｅｄ?ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ?ｉｎｖｏｌｖｅｓ?ｔｈｒｅｅ?ｓｔｅｐｓ＇４２１．??（三）ＲｅｃＥＴ：山東大學(xué)張友明教授課題組，開發(fā)了一種基于Ｒｅｃ前噬菌體重組酶??ＲｅｃＥ和ＲｅｃＴ的基因簇捕捉技術(shù)，命名為ＲｅｃＥＴ［４４】。其中ＲｅｃＥ具有５’？３’?ＤＮＡ外切??酶活性，ＲｅｃＴ可結(jié)合單鏈ＤＮＡ，形成核酸－蛋白復(fù)合物，保護(hù)申．鏈丨）ＮＡ突出端小被核??酸酶外叻酶Ｖ降解ＭｉＵＲｅｃＥＴ技術(shù)就是利用ＲｅｃＥ外切酶叻制丨Ｉ的片段產(chǎn)生粘性末端，??并在ＲｅｃＴ的保護(hù)和引導(dǎo)下與其互補(bǔ)ＤＮＡ發(fā)生同源重組ＨＩ。該方法只需將捕捉載體兩??端通過ＰＣＲ技術(shù)添加５０?ｂｐ左右的同源臂，即可從提純的基因組ＤＮＡ上直接克隆小于??５０?ｋｂ的目的片段，克隆過程發(fā)生在含有ＲｅｃＥＴ系統(tǒng)的Ｅ．ｃｏ／／內(nèi)丨４４】。利用ＲｅｃＥＴ重組系??統(tǒng)在伯克氏菌ＤＳＭ?７０２９基因組中獲得了?ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎ（２８ｋｂ）生物合成基因簇＾１，技術(shù)流??程如圖丨－５。該技術(shù)首先要提取完整性高的基因組ＤＮＡ，通過ＳｎａｐＧｅｎｅ從ｆｌ的基丨Ａ１族??兩端取

優(yōu)化與ＣＡＴ－ＦＩＳＨＩＮＧ技術(shù)的建立與表??征??３．１?ＣＡＴ－ＦＩＳＨ丨ＮＧ技術(shù)設(shè)計(jì)原理??通過偶聯(lián)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｌ２ａ的ＤＮＡ切割活性與ＢＡＣ文庫構(gòu)建的獨(dú)特特性，我們開??發(fā)了?ＣＡＴ－ＦＩＳＨＩＮＧ?（Ｃ’ＲｌＳＰＲ／Ｃａｓｌ２ａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｆａｓｔ?ｄｉｒｅｃｔ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｇｅｎｅ?ｃｌｕｓｔｅｒ?ｃｌｏｎｉｎｇ??ｐｌａｔｆｏｒｍ），這是一個(gè)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｌ２ａ介導(dǎo)的簡單快速的生物合成基因簇直接克隆平臺，??可實(shí)現(xiàn)大型ＢＧＣ的體外克攏圖３－１展示了?ＣＡＴ－ＦＩＳＨＩＮＧ的三步流程圖。??ＤＮ?Ａ?ｓａｍｐｌｅ?ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?Ｆｌａｎｋｅｄ?ｈｏｍｏｌｏｇ?ａｒｍｓ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ??（ｅ．ｇ．?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ）???＼?￣?ＰＣＲ????ｋ?ｆ?ＰＡＭ２?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?」?■ＨＥＩｄ＂??Ｈｏｍｏｌｏｇ?ａｒｍｓ?ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ??ｉ?ｒ?ｂｙ?Ｇｉｂｓｏｎ?ａｓｓｅｍｂｌｙ??Ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ??ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ?Ｃａｐｔｕｒｅ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ??Ｔａｒｇｅｔ?ＢＧＣ?（＿＞??（Ｗｉｔｈ?ｓｔａｇｇｅｒｅｄ?Ｃａｓ１２ａ?ｃｌｅａｖａｇｅ?ｓｉｔｅｓ）?｜??￣￣３?＇?ｏｒｉＳ?＾??＋?＾??Ｌｉｎｅａｒ?ｃａｐｔｕｒｅ?ｐｌａｓｍｉｄ?Ｐｌａｓｍｉｄ?ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?ｔａｒｇｅｔ?ＢＧＣ??（ｗｉｔｈ?ｓｔａｇｇｅｒｅｄ?Ｃａｓ１２ａ?ｃｌｅａｖａｇｅ?ｓｉｔｅｓ）??Ｌｉｇａｔｉｏｎ?＆??ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ??ｏｒｉＳ??ｏ


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