甜瓜（Cucumis melo L.）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,其生長發(fā)育經(jīng)常受到各種病害的影響,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。白粉病是甜瓜生產(chǎn)中的重要病害,危害植株全株,伴隨著生長發(fā)育的整個(gè)過程。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí),植物體內(nèi)會發(fā)生一系列生理生化變化,形成復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,將外界信號傳遞到細(xì)胞內(nèi),從而引起抗逆基因表達(dá),抵御逆境脅迫。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activted protein kinase,MAPK）級聯(lián)途徑在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CmMAPK3和CmMAPK7受紅光(160μmol m^-2s^-1·6 h)誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),甜瓜幼苗接種白粉病菌后其表達(dá)量高于對照,但紅光誘導(dǎo)后再接菌,兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平低于單獨(dú)接菌處理。因此,我們構(gòu)建了病毒誘導(dǎo)基因沉默載體,對兩個(gè)基因的抗白粉病功能做了初步研究,主要結(jié)果如下:1.采用In-Fusion方法,構(gòu)建CmMAPK3和CmMAPK7沉默載體。在甜瓜幼苗子葉完全展開時(shí),利用子葉注射法將菌液（TRV:00,TRV:CmMAPK3,TRV:CmMAPK7）真空... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

MAPK級聯(lián)信號途徑傳遞外界信號示意圖（Danquahetal.,2014）

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文152min，在超凈工作臺中加入890μLLB液體培養(yǎng)基，37℃150r震蕩培養(yǎng)1h后，取150μL菌液涂布到LB固體培養(yǎng)基（100mg/mLAmp）上，37℃倒置培養(yǎng)14h。待平板長出單菌落后，用槍頭挑取單菌落到1mLLB液體培養(yǎng)基（100mg/mLAmp）中，37℃震蕩培養(yǎng)14h。此菌液用于PCR鑒定：成分Constituents體積VolumeExTaq酶（PremixTaq）12.5μLF1μLR1μL菌液1μLddH2Oupto25μL反應(yīng)程序?yàn)?8℃30s；98℃10s；60℃15s；72℃1min40s；72℃10min，循環(huán)數(shù)35。后進(jìn)行凝膠電泳篩選陽性克隆，對其進(jìn)行編號后送測序，并于-80℃保存菌液。2.2.3CmMAPK3和CmMAPK7基因沉默表達(dá)載體的構(gòu)建使用In-Fusion方法構(gòu)建CmMAPK3和CmMAPK7基因沉默表達(dá)載體。首先根據(jù)基因登錄號從甜瓜基因組網(wǎng)站下載甜瓜MAPK所有基因序列，利用DNAMAN進(jìn)行序列同源比對，找到CmMAPK3和CmMAPK7約300bp的特異序列。根據(jù)選擇的沉默片段設(shè)計(jì)In-Fusion引物（表2），限制性酶切位點(diǎn)為BamHI，載體為pTRV2（圖2）。圖2pTRV2載體圖譜Fig.2ConstructdiagramofpTRV2vector以克隆得到的CmMAPK3，CmMAPK7質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增序列約300bp保守序列：98℃30s；98℃10s；60℃15s；72℃20s；72℃10min，循環(huán)數(shù)35。反應(yīng)體系為

磁嘌?2h；測菌液OD600=1.6時(shí)，于4℃5000r下離心10min，收集菌體。此時(shí)，配置侵染緩沖液，將500mMMES10mL，50mMAS1.5mL和1MMgCl2·6H2O5mL加入500mL無菌水中，混勻即為侵染緩沖液。使用侵染緩沖液懸浮菌體，使懸浮液OD600=1.0，將pTRV1分別與TRV:CmMAPK3，TRV:CmMAPK7，pTRV2混合（v:v=1:1），于室溫下黑暗靜置3h。將制備好的侵染液命名為TRV:00，TRV:CmMAPK3和TRV:CmMAPK7。子葉注射法侵染薄皮甜瓜幼苗：使用一次性注射器將TRV:00，TRV:CmMAPK3和TRV:CmMAPK7侵染液分別注射到薄皮甜瓜子葉背面，使其完全浸透兩片子葉（圖3）。黑暗放置24h后于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。圖3子葉注射法侵染薄皮甜瓜幼苗子葉Fig.3Cotyledoninjectioninfectedcotyledonofmuskmelonseeding2.2.5病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)白粉病菌侵染嚴(yán)重程度分為4級，1級：白粉病菌覆蓋葉面積<25%；2級：25%<白粉病菌覆蓋葉面積<50%；3級：50%<白粉病菌覆蓋葉面積<75%；4級：白粉病菌覆蓋

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]甜瓜MAPK級聯(lián)途徑基因家族的鑒定及CmMPKs功能分析[D]. 李悅鵬.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[2]野生草莓WRKY和MAPK基因家族鑒定、表達(dá)及FvWRKY42基因功能研究[D]. 未魏.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2017
[3]橢圓灰葡萄孢（Botrytis cinerea）脅迫下亞洲百合的生理響應(yīng)及調(diào)節(jié)基因MAPK的克隆[D]. 宋翔宇.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
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本文編號：3333726