CRISPR/Cas9是新興的基因組編輯技術(shù),該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、效率高,已成為目前最主流的基因組編輯技術(shù)。利用該技術(shù)進(jìn)行突變體創(chuàng)制,對(duì)基因功能研究和育種應(yīng)用具有重要的意義,而快速、高效、低成本的基因編輯個(gè)體鑒定是其中的重要環(huán)節(jié)。本研究對(duì)影響CELⅠ粗提物鑒定CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻基因編輯個(gè)體的條件,包括蛋白用量及作用時(shí)間、PCR反應(yīng)緩沖液等條件進(jìn)行了探索,并將整個(gè)檢測(cè)體系集成于一管操作。同時(shí),采用CELⅠ粗提物檢測(cè)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)水稻stn1突變的T₀代植株及后代,對(duì)雜合突變、純合突變及雙等位突變的鑒定策略進(jìn)行了探討;該方法檢測(cè)正確率經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證達(dá)100%。上述結(jié)果表明,采用CELⅠ粗提物檢測(cè)突變體與已有方法比較具有廉價(jià)、快速和高效的特點(diǎn)。 

【文章來(lái)源】：生物工程學(xué)報(bào). 2017,33(05)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

CRISPR載體圖譜和stn1的CRISPR靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

?或加等量的野生型DNA擴(kuò)增產(chǎn)物)迚行變、性理，再向其中加CELⅠ酶，42℃溫育，用EDTA終止反應(yīng)。取10μL樣品迚行電泳檢測(cè)。2結(jié)果與討論2.1CELⅠ酶粗提物用于突變體的檢測(cè)dep1是水稻立密穗制基因[23]，本論文dep1-29突變株由本實(shí)驗(yàn)室制，測(cè)序結(jié)果明，該植株為雙點(diǎn)突變(–2/–5)(圖2)。為檢測(cè)CELⅠ酶粗物是否切割異源雙鏈DNA，取1μLCELⅠ酶粗物加到經(jīng)變性、性理的PCR樣品中，與不加CELⅠ酶的樣品迚行對(duì)比。電泳結(jié)果顯示CELⅠ酶可以切割異源雙鏈DNA，切出帶符合預(yù)期，證明CELⅠ酶粗物適用于點(diǎn)突變的檢測(cè)。圖2dep1-29突變株突變位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果和CELⅠ酶切檢測(cè)結(jié)果(dep1-29a和dep1-29b表示dep1-29突變株包含雙等位突變的兩種突變類型)Fig.2Sequenceofdep1-29mutantandCELⅠanalysis.dep1-29aanddep1-29bshowedthetargetsequencesofbi-allelesmutationofdep1-29.

撓昧浚?蓋行Ч?換嵊邢災(zāi)???酶切時(shí)間是影響酶切效果的另一重要因素。采用0.1μgCELⅠ酶對(duì)dep1-29突變體材料的PCR產(chǎn)物迚行酶切(圖3)。結(jié)果明，CELⅠ酶作用10min時(shí)可以見(jiàn)到酶切的帶，隨著時(shí)間增加，CELⅠ酶的切割效逐漸升，在40min時(shí)達(dá)到最佳。繼續(xù)增加時(shí)間不升CELⅠ酶的切割效。2.3PCR體系對(duì)CELⅠ切割效率的影響簡(jiǎn)、快捷的突變體鑒定法要求采用CELⅠ粗物在合適的PCR緩沖體系中迚行酶切。因此，首先選目前普遍使用的聚合酶和緩沖系統(tǒng)(rTaq聚合酶、LATaq聚合酶、BlendTaq聚合酶、KOD聚合酶)迚行實(shí)驗(yàn)(圖4)。結(jié)圖3CELⅠ酶粗提物用量及酶切時(shí)間對(duì)突變鑒定的影響Fig.3EffectsoftheamountofCELⅠcrudeextractsanddigestiontimeonmutationidentification.圖4不同PCR體系對(duì)CELⅠ粗提物酶切效率的影響Fig.4EffectofdigestionusingCELⅠcrudeextractsindifferentPCRsystems.果明，KOD酶的擴(kuò)增效果最佳，CELⅠ酶在該體系中的切割效果不理想。BTaq酶體系和rTaq酶體系中PCR擴(kuò)增效果差，電泳檢測(cè)時(shí)不看見(jiàn)1000bp的帶。LATaq酶體系夠擴(kuò)增到dep1片段，且CELⅠ酶在該體系中現(xiàn)出了切割活性。迚一步通過(guò)采用LAbuffer與不同的Taq酶組合，収現(xiàn)BTaq與LAbuffer組合可以高PCR的效和保證CELⅠ的酶切活性。2.4CELⅠ酶對(duì)CRISPR介導(dǎo)的stn1基因敲除株突變進(jìn)行分型采用農(nóng)桿菌導(dǎo)的法，我們將stn1-CRISPR轉(zhuǎn)化水稻，獲得35個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。由于轉(zhuǎn)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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