目的發(fā)現(xiàn)并確認膀胱癌致癌基因TOP2A的上游miRNA,并探討其在膀胱癌中發(fā)揮的具體作用及可能機制。方法starBase數(shù)據(jù)庫用于預(yù)測膀胱癌中潛在和TOP2A結(jié)合的miRNAs,并運用TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘?qū)λ蓄A(yù)測的miRNAs與靶基因的相關(guān)性和生存分析進行排序;根據(jù)預(yù)測的結(jié)合位點情況構(gòu)建雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪透蓴_實驗,以確認候選基因miR-101-3p和TOP2A基因的結(jié)合情況;qRT-PCR用于分析兩基因在臨床組織水平表達相關(guān)性;運用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在膀胱癌細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimics和inhibitor及各自的陰性對照,隨后采用CCK8,細胞劃痕愈合實驗和Transwell實驗測定細胞的增殖及遷移能力變化情況;細胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)和細胞功能回復(fù)實驗以明確miR-101-3p/TOP2A信號軸在腫瘤細胞惡性表型中的調(diào)控作用。結(jié)果 starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測獲得147個miRNAs;TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示,miR-101-3p和TOP2A基因相關(guān)系數(shù)最高,且與膀胱癌患者不良預(yù)后密相關(guān),作為后續(xù)實驗候選基因;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪透蓴_實驗證實兩者在膀胱癌中的結(jié)合能力,miR... 

【文章來源】：現(xiàn)代泌尿外科雜志. 2020,25(08)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

TOP2A的調(diào)控基因miR-101-3p與膀胱癌預(yù)后的相關(guān)性

根據(jù)預(yù)測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在TOP2A的3′UTR區(qū)域存在和miR-101-3p結(jié)合的位點（圖2A）；據(jù)此，我們設(shè)計了熒光素酶報告基因?qū)嶒�，通過構(gòu)建TOP2A基因的野生型和突變型基因，并同時導(dǎo)入含有熒光素酶活性的miR-101-3p mimics類似物進入膀胱癌細胞系T24中，隨后測定熒光素酶的活性以判斷兩者的結(jié)合關(guān)系，發(fā)現(xiàn)野生型中熒光素酶活性減退，而突變型中未見明顯變化，這說明兩者在預(yù)測區(qū)域存在結(jié)合關(guān)系（圖2B）；同時，我們設(shè)計的干擾實驗更進一步說明兩者表達的相關(guān)性，在膀胱癌細胞系中分別轉(zhuǎn)染mimics NC和miR-101-3p mimics，并測定TOP2A基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-101-3p mimics組細胞中的TOP2A基因表達下調(diào)（圖2C）；隨后，我們測定臨床組織標本中miR-101-3p的表達數(shù)據(jù)并和TOP2A進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中miR-101-3p表達下調(diào)，同時兩者的表達水平具有負相關(guān)的關(guān)系（圖2D、E）；這說明在膀胱癌中，miR-101-3p能夠直接結(jié)合靶基因TOP2A且負調(diào)控靶基因的表達。2.3 上調(diào)miR-101-3p表達能夠抑制膀胱癌的增殖和遷移能力

我們?yōu)榱舜_認在膀胱癌中miR-101-3p/TOP2A信號軸對膀胱癌細胞生物學(xué)功能的影響，設(shè)計了功能回復(fù)實驗。我們運用細胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)，在膀胱癌細胞系中分別轉(zhuǎn)染miR-101-3p NC、miR-101-3p mimics和miR-101-3p mimics+pcDNA3.0TOP2A，并運用CCK-8實驗測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)TOP2A基因表達后，可以恢復(fù)腫瘤細胞的增殖能力（圖4A）；運用劃痕愈合實驗測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)TOP2A基因表達，腫瘤細胞的遷移能力受限制情況變?nèi)酰▓D4B）；運用Transwell實驗測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-101-3p表達后，腫瘤細胞的侵襲能力出現(xiàn)部分恢復(fù)（圖4C）。綜上，miR-101-3p在膀胱癌細胞中是通過下調(diào)TOP2A基因的表達發(fā)揮抑制腫瘤惡性進展的作用。圖4 高表達TOP2A可以恢復(fù)膀胱癌細胞的增殖和遷移能力


本文編號：3328056