發(fā)布時(shí)間：2021-08-07 15:30

　　目的發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)膀胱癌致癌基因TOP2A的上游miRNA,并探討其在膀胱癌中發(fā)揮的具體作用及可能機(jī)制。方法starBase數(shù)據(jù)庫(kù)用于預(yù)測(cè)膀胱癌中潛在和TOP2A結(jié)合的miRNAs,并運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘?qū)λ蓄A(yù)測(cè)的miRNAs與靶基因的相關(guān)性和生存分析進(jìn)行排序;根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)情況構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和干擾實(shí)驗(yàn),以確認(rèn)候選基因miR-101-3p和TOP2A基因的結(jié)合情況;qRT-PCR用于分析兩基因在臨床組織水平表達(dá)相關(guān)性;運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在膀胱癌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimics和inhibitor及各自的陰性對(duì)照,隨后采用CCK8,細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的增殖及遷移能力變化情況;細(xì)胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)和細(xì)胞功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)以明確miR-101-3p/TOP2A信號(hào)軸在腫瘤細(xì)胞惡性表型中的調(diào)控作用。結(jié)果 starBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)獲得147個(gè)miRNAs;TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,miR-101-3p和TOP2A基因相關(guān)系數(shù)最高,且與膀胱癌患者不良預(yù)后密相關(guān),作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)候選基因;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者在膀胱癌中的結(jié)合能力,miR... 

【文章來(lái)源】：現(xiàn)代泌尿外科雜志. 2020,25(08)

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

TOP2A的調(diào)控基因miR-101-3p與膀胱癌預(yù)后的相關(guān)性

根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在TOP2A的3′UTR區(qū)域存在和miR-101-3p結(jié)合的位點(diǎn)（圖2A）；據(jù)此，我們?cè)O(shè)計(jì)了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，通過(guò)構(gòu)建TOP2A基因的野生型和突變型基因，并同時(shí)導(dǎo)入含有熒光素酶活性的miR-101-3p mimics類似物進(jìn)入膀胱癌細(xì)胞系T24中，隨后測(cè)定熒光素酶的活性以判斷兩者的結(jié)合關(guān)系，發(fā)現(xiàn)野生型中熒光素酶活性減退，而突變型中未見(jiàn)明顯變化，這說(shuō)明兩者在預(yù)測(cè)區(qū)域存在結(jié)合關(guān)系（圖2B）；同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)的干擾實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步說(shuō)明兩者表達(dá)的相關(guān)性，在膀胱癌細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染mimics NC和miR-101-3p mimics，并測(cè)定TOP2A基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-101-3p mimics組細(xì)胞中的TOP2A基因表達(dá)下調(diào)（圖2C）；隨后，我們測(cè)定臨床組織標(biāo)本中miR-101-3p的表達(dá)數(shù)據(jù)并和TOP2A進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中miR-101-3p表達(dá)下調(diào)，同時(shí)兩者的表達(dá)水平具有負(fù)相關(guān)的關(guān)系（圖2D、E）；這說(shuō)明在膀胱癌中，miR-101-3p能夠直接結(jié)合靶基因TOP2A且負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。2.3 上調(diào)miR-101-3p表達(dá)能夠抑制膀胱癌的增殖和遷移能力

我們?yōu)榱舜_認(rèn)在膀胱癌中miR-101-3p/TOP2A信號(hào)軸對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，設(shè)計(jì)了功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)。我們運(yùn)用細(xì)胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)，在膀胱癌細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染miR-101-3p NC、miR-101-3p mimics和miR-101-3p mimics+pcDNA3.0TOP2A，并運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)TOP2A基因表達(dá)后，可以恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的增殖能力（圖4A）；運(yùn)用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)TOP2A基因表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的遷移能力受限制情況變?nèi)酰▓D4B）；運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-101-3p表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力出現(xiàn)部分恢復(fù)（圖4C）。綜上，miR-101-3p在膀胱癌細(xì)胞中是通過(guò)下調(diào)TOP2A基因的表達(dá)發(fā)揮抑制腫瘤惡性進(jìn)展的作用。圖4 高表達(dá)TOP2A可以恢復(fù)膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移能力


本文編號(hào)：3328056