家蠶（Bombyx mori）是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目模式生物。滯育和變態(tài)發(fā)育是家蠶重要的特性,其分子機(jī)制的研究一直是蠶業(yè)科學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn),迄今仍未完全闡明。家蠶是典型的卵滯育昆蟲,根據(jù)其在自然條件下1年發(fā)生的世代數(shù)可分為一化性、二化性和多化性,根據(jù)幼蟲期眠或蛻皮的次數(shù)又可分為三眠蠶、四眠蠶和五眠蠶。為深入了解家蠶山梨醇脫氫酶基因BmSDH的特性、蛻皮激素合成途徑（Ecdysteroidogenic Pathway,EP）Shadow基因在滯育和變態(tài)發(fā)育中的作用,本文以家蠶二化性品種秋豐為材料,利用5’RACE、qRT-PCR和CRISPR/Cas9等技術(shù),研究BmSDH與Shadow基因的功能,取得以下主要結(jié)果。1.家蠶山梨醇脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定及啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析。用5′RACE技術(shù)確定BmSDH基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);利用NNPP、JASPAR、Alibaba2.1等在線軟件對轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb及下游200 bp序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明,BmSDH-1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為A（-41）,BmSDH-2a的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為C（-41）,BmSDH-2b的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為A（-40）（... 

【文章來源】：江蘇科技大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

泛色素合成途徑[20]

圖 1.2 果蠅變態(tài)發(fā)育過程中蛻皮激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[60]Fig 1.2 The signal transduction pathways of 20- E during metamorphosis in fruitfly[60]1.5 基因編輯研究進(jìn)展1.5.1 基因組編輯技術(shù)概述通過核酸酶對目標(biāo) DNA 進(jìn)行定點(diǎn)敲除、敲入以及突變等操作，最終使目標(biāo)基因的表達(dá)水平下調(diào)或上調(diào)，使得細(xì)胞或個(gè)體得到一個(gè)新的表型目標(biāo)，這樣的技術(shù)我們稱之為基因編輯。傳統(tǒng)的基因操作由于效率低、精確度差等問題，嚴(yán)重滯后于基因組研究的進(jìn)展。近年來，新發(fā)展的基因編輯方法有鋅指核酸酶技術(shù)、TALEN 技術(shù)和CRISPR/Cas 技術(shù)等通過特異性識(shí)別，可以達(dá)到精確切割基因組 DNA 序列的效果，同時(shí)誘發(fā)同源重組或非同源末端鏈接[61]。這些技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于基因結(jié)構(gòu)與功能的研究和多種細(xì)胞的基因工程改造，為疾病模型的建立、動(dòng)植物新品種的培育及基因治療等的研究提供新的手段。ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)皆是通過在特定的靶位點(diǎn)處切割雙鏈，形

圖 1.3 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9 基因編輯的原理[62]Fig 1.3 the principle of ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9[62]結(jié)構(gòu)與分類細(xì)菌基因組廣泛存在 CRISPR 簇家族序列，作為防御外源目前在 40 %的已測序細(xì)菌和 90 %的已測序古細(xì)菌中都有主要由多個(gè)高度保守重復(fù)約為 25-50 bp 長度的序列和間PR 位點(diǎn)中的重復(fù)序列保守性較高，尤其在 5’端與 3’ 端的 CRISPR 序列包含的間隔序列的數(shù)量差別很大，少至/Cas 系統(tǒng)可以分為 Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型 3 大類：Ⅰ型和Ⅲ切割與降解必需兩種以上的Cas蛋白參與；而Ⅱ型系統(tǒng)只DNA 雙鏈，組分較為簡單，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)也較為方便除體系應(yīng)該包含有 Cas9 和 gRNA 2 個(gè)元件，在這里 Cas 和破壞雙鏈 DNA，而決定 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在應(yīng)用時(shí) C于 gRNA 5'端的大約 20 bp 的序列，該序列決定了 CRIS

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建AEG-1基因敲除U251細(xì)胞系并探討其轉(zhuǎn)移行為的特點(diǎn)[J]. 盛玉瑞,李斌,王斌,左娣,馬琳,任曉璠,郭樂,劉昆梅.  中國生物工程雜志. 2018(10)
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博士論文
[1]家蠶防御球孢白僵菌感染相關(guān)免疫基因的研究[D]. 呂丁丁.江蘇科技大學(xué) 2017
[2]家蠶新突變體二齡不眠蠶基因的定位克隆及功能研究[D]. 吳凡.江蘇科技大學(xué) 2016
[3]Homeodomain轉(zhuǎn)錄因子對家蠶保幼激素及蛻皮激素合成的調(diào)控[D]. 孟勐.西南大學(xué) 2015
[4]CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)在家蠶基因功能研究中的應(yīng)用[D]. 辛虎虎.浙江大學(xué) 2015
[5]家蠶細(xì)胞色素P450基因及其定量方法的研究[D]. 衛(wèi)正國.蘇州大學(xué) 2009
[6]家蠶（Bombyx mori）全基因組細(xì)胞色素P450基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析及CYP18A1克隆與功能研究[D]. 艾均文.西南大學(xué) 2008
[7]棉鈴蟲細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)、純化及其性質(zhì)研究[D]. 鄭明奇.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2003



本文編號：3326963