CRISPR/Cas9基因編輯實驗系統(tǒng)建立及CBX2調(diào)控性別發(fā)育基因的功能初探
發(fā)布時間：2021-08-02 02:21
CBX蛋白作為哺乳動物多梳抑制復(fù)合體PRC1的核心組分在干細胞干性維持和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。哺乳動物CBX同源蛋白Cbx2敲除型小鼠出現(xiàn)雄性-雌性的性別逆轉(zhuǎn),類似的發(fā)育異�，F(xiàn)象在人類Cbx2點突變的病例中也有報道。目前有一定實驗證據(jù)表明CBX2可能通過調(diào)控性別決定基因Sry及Nr5a1基因的表達調(diào)控性別發(fā)育,但由于其效應(yīng)顯示為基因激活作用,與已知的PRC1抑制基因表達的效應(yīng)不吻合,具體的調(diào)控機制目前還不明確。為了深入探究CBX2調(diào)控性別發(fā)育的機制,對Cbx2進行敲除和過表達等基因操作必不可少。而此時一種新型基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9應(yīng)運而生,操作簡便快速高效,因此本論文嘗試應(yīng)用了多種CRISPR/Cas9體系去進行Cbx2基因的敲除。通過建立并不斷完善本實驗室CRISPR/Cas9系統(tǒng),得到了高效率的瞬時轉(zhuǎn)染實驗系統(tǒng)和慢病毒載體感染系統(tǒng),并且構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達Cas9的多種細胞系,能夠較為成熟簡便地使用CRISPR/Cas9對人胚腎細胞HEK293T、小鼠胚胎干細胞E14TG2a和小鼠睪丸畸胎瘤細胞F9等不同細胞系進行基因編輯。目前已使用瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)得到了純合型和雜合...
【文章來源】：蘭州大學(xué)甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：66 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
PRC1分類示意圖[13]
蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 CRISPR/Cas9 基因編輯實驗系統(tǒng)建立及 CBX2 調(diào)控性別發(fā)育基因的功能初探RING1B[62, 63]。與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域相鄰，這些 CBX 同源物具有 DNA 結(jié)合基序AT-Hook（在 CBX2 中）或 AT-Hook Like 基序（在其他四個 CBX 蛋白中）[64]。CBX 蛋白中這些較不保守的序列可以將每個 CBX 家族成員特異性地導(dǎo)向染色質(zhì)的不同區(qū)域[65]。
圖 1-6 通過強制表達 Sry 或 Sox9 獲得的 Cbx2 KO 成年性腺的總體形態(tài)[1]表 1-4 性別發(fā)育相關(guān)基因的功能基因 功能 引用sf1 與性腺中支持細胞和間質(zhì)細胞的形成有關(guān)，并介導(dǎo) SRY 表達上調(diào) [6]Wt1 Wt1 突變的小鼠腎臟和性腺不發(fā)育，通常在胚胎階段即死于心臟缺陷 [12]Gata4 與 SF1，F(xiàn)OG2，WT1 等協(xié)同作用，調(diào)節(jié) SRY、SOX9、AMH 等性別相關(guān)基因的表達 [15]Lhx9 Lhx9 缺失的小鼠，其胚胎時期原始生殖細胞可正常遷移，但生殖腺嵴中體細胞無法增殖，性腺形成受阻，由于缺乏睪酮和 AMH，XY 小鼠表型為雌性[17]Cbx2（M33） XY 小鼠體內(nèi)，M33 基因缺失導(dǎo)致性逆轉(zhuǎn)；在 XX 小鼠則體現(xiàn)為卵巢的體積減小或缺失[1]Insr 缺乏功能性 INS/IGF 信號的胚胎表現(xiàn)出：腎上腺皮質(zhì)完全不發(fā)育；XY 性腺性逆轉(zhuǎn)；卵巢分化延遲，即 XX 和 XY 性腺未分化狀態(tài)延長Igflr1Sry Y 染色體上決定雄性性別的基因片段，在性別決定中起開關(guān)作用Sox9 條件敲除 Sox9 基因的小鼠 XY 胚胎出現(xiàn)卵巢發(fā)育，而過度表達 Sox9 的 XX 胚胎出現(xiàn)睪丸發(fā)育[18]
【參考文獻】：
期刊論文
[1]多梳抑制復(fù)合體PRC1的核心組分CBX家族蛋白在表觀遺傳調(diào)控中的作用（英文）[J]. Rong-gang MA,Yang ZHANG,Ting-ting SUN,Bo CHENG. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2014(05)
[2]46,XY女性性逆轉(zhuǎn)患者的NR5A1基因突變分析[J]. 陳雪嬌,許惠惠,潘映秋,戴美珍,范歷龍,章鴦. 醫(yī)學(xué)研究雜志. 2013(03)
[3]合肥地區(qū)性逆轉(zhuǎn)綜合征患者遺傳學(xué)研究[J]. 趙保靜,袁靜,方慧琴,李從青,叢林. 中國優(yōu)生與遺傳雜志. 2012(10)
本文編號：3316694
【文章來源】：蘭州大學(xué)甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：66 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
PRC1分類示意圖[13]
蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 CRISPR/Cas9 基因編輯實驗系統(tǒng)建立及 CBX2 調(diào)控性別發(fā)育基因的功能初探RING1B[62, 63]。與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域相鄰，這些 CBX 同源物具有 DNA 結(jié)合基序AT-Hook（在 CBX2 中）或 AT-Hook Like 基序（在其他四個 CBX 蛋白中）[64]。CBX 蛋白中這些較不保守的序列可以將每個 CBX 家族成員特異性地導(dǎo)向染色質(zhì)的不同區(qū)域[65]。
圖 1-6 通過強制表達 Sry 或 Sox9 獲得的 Cbx2 KO 成年性腺的總體形態(tài)[1]表 1-4 性別發(fā)育相關(guān)基因的功能基因 功能 引用sf1 與性腺中支持細胞和間質(zhì)細胞的形成有關(guān)，并介導(dǎo) SRY 表達上調(diào) [6]Wt1 Wt1 突變的小鼠腎臟和性腺不發(fā)育，通常在胚胎階段即死于心臟缺陷 [12]Gata4 與 SF1，F(xiàn)OG2，WT1 等協(xié)同作用，調(diào)節(jié) SRY、SOX9、AMH 等性別相關(guān)基因的表達 [15]Lhx9 Lhx9 缺失的小鼠，其胚胎時期原始生殖細胞可正常遷移，但生殖腺嵴中體細胞無法增殖，性腺形成受阻，由于缺乏睪酮和 AMH，XY 小鼠表型為雌性[17]Cbx2（M33） XY 小鼠體內(nèi)，M33 基因缺失導(dǎo)致性逆轉(zhuǎn)；在 XX 小鼠則體現(xiàn)為卵巢的體積減小或缺失[1]Insr 缺乏功能性 INS/IGF 信號的胚胎表現(xiàn)出：腎上腺皮質(zhì)完全不發(fā)育；XY 性腺性逆轉(zhuǎn)；卵巢分化延遲，即 XX 和 XY 性腺未分化狀態(tài)延長Igflr1Sry Y 染色體上決定雄性性別的基因片段，在性別決定中起開關(guān)作用Sox9 條件敲除 Sox9 基因的小鼠 XY 胚胎出現(xiàn)卵巢發(fā)育，而過度表達 Sox9 的 XX 胚胎出現(xiàn)睪丸發(fā)育[18]
【參考文獻】：
期刊論文
[1]多梳抑制復(fù)合體PRC1的核心組分CBX家族蛋白在表觀遺傳調(diào)控中的作用（英文）[J]. Rong-gang MA,Yang ZHANG,Ting-ting SUN,Bo CHENG. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2014(05)
[2]46,XY女性性逆轉(zhuǎn)患者的NR5A1基因突變分析[J]. 陳雪嬌,許惠惠,潘映秋,戴美珍,范歷龍,章鴦. 醫(yī)學(xué)研究雜志. 2013(03)
[3]合肥地區(qū)性逆轉(zhuǎn)綜合征患者遺傳學(xué)研究[J]. 趙保靜,袁靜,方慧琴,李從青,叢林. 中國優(yōu)生與遺傳雜志. 2012(10)
本文編號：3316694
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