結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L.var.capitata L.）,簡(jiǎn)稱甘藍(lán),是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中兩年生的重要蔬菜作物。甘藍(lán)為典型的異花授粉作物,具有自交不親和的特點(diǎn),長(zhǎng)期依賴于人工蕾期自交授粉繁殖自交不親和原種,工作量大,雜交率很難達(dá)到100%。進(jìn)入本世紀(jì)以后,甘藍(lán)雜交育種的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了雄性不育系的選育和利用。其中細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）的利用最為普遍,存在恢復(fù)源限制,胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)、胞質(zhì)單一化等問(wèn)題。針對(duì)當(dāng)前甘藍(lán)雄性不育工作中存在的雄性不育遺傳資源狹窄,過(guò)度利用蘿卜Ogura CMS不育源,單一胞質(zhì)使用的潛在風(fēng)險(xiǎn)以及因嚴(yán)重缺乏優(yōu)良甘藍(lán)自交親和系制約了甘藍(lán)雄性不育雜交育種發(fā)展和應(yīng)用等問(wèn)題,本研究擬通過(guò)甘藍(lán)細(xì)胞核不育系和自交親和性系的創(chuàng)制,擴(kuò)大甘藍(lán)雄性不育資源,規(guī)避單一胞質(zhì)使用風(fēng)險(xiǎn),促進(jìn)甘藍(lán)雄性不育雜交育種的發(fā)展。隨著控制甘藍(lán)雄性不育和自交不親和性基因明確,以基因組編輯為主的反向遺傳學(xué)技術(shù)可以對(duì)目的基因的靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)改造,為培育自交親和的雄性不育系提供了可能。本試驗(yàn)以甘藍(lán)為研究對(duì)象,利用RNAi、優(yōu)化的CRISPR/Cas9等技術(shù),對(duì)甘藍(lán)BoEMS1、BoSRK以及Bo... 

【文章來(lái)源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：113 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

茉莉酸（JA）生物合成途徑Fig.1-1Biosynthesisofjasmonates

進(jìn)一步分析 CRISPR/Cas 的結(jié)構(gòu)主要如下三個(gè)部分：一個(gè) CRISPR 簇，包括一段非常保守的重復(fù)序列（repeat）和長(zhǎng)度相似的間隔序列（spacer）；CRISPR 簇前端的引導(dǎo)序列（leader sequence）；CRISPR 簇側(cè)翼的一些輔助基因（CRISPRassociated genes，cas），如圖 1-2 所示。目前研究發(fā)現(xiàn) CRISPER/Csa9 系統(tǒng)有 3 種，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，由于Ⅰ型和Ⅲ型的工作機(jī)制較為復(fù)雜，需要復(fù)雜的 Cas 蛋白系統(tǒng)參與完成。而Ⅱ型只需要 Cas9 這一種蛋白參與免疫過(guò)程，其結(jié)構(gòu)組成相對(duì)簡(jiǎn)單，是目前研究最深入類型(Makarova et al.，2011)。CRISPER/Csa9 Ⅱ型系統(tǒng)一般經(jīng)過(guò)3 個(gè)階段：（1）間隔區(qū) spacer 的獲得；（2）crRNA（CRISPR-derived RNA）的加工；（3）target 的干擾(Wiedenheft et al.，2012)。第一階段將外源 DNA 片段通過(guò)非同源重組整合到 CRISPR 簇中，形成一個(gè)新的間隔序列；第二階段的完成是在前導(dǎo)序列 PAMs 作用下的 CRISPR 基因座位點(diǎn)形成前體 RNA（pre-crRNA），通過(guò) Cas9蛋白和 RNAaseⅢ核酸酶的剪切、加工形成成熟 crRNA(Karginov et al.，2010)；第三階段當(dāng)宿主菌再次受到外源 DNA 侵染時(shí)，crRNA 和 tracrRNA（trans-activatingchimeric RNA）形成的復(fù)合體特異性結(jié)合外源 DNA，在 Cas9 蛋白核酸內(nèi)切酶的作用下剪切雙鏈 DNA 最終達(dá)到保護(hù)宿主菌的目的(Garneau et al.，2010)。

(3) tRNA-sgRNA 表達(dá)系統(tǒng)CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重編輯效率往往會(huì)受到 sgRNA 表達(dá)策略的限制。為此，賓夕法尼亞大學(xué)的 Yang 教授的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于 CRISPR 編輯技術(shù)的新系統(tǒng)，以期尋找一種簡(jiǎn)便、高效編輯多基因位點(diǎn)的方法。tRNA 加工系統(tǒng)包含了啟動(dòng)子元件、poⅢ等，其作用相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，能夠精確切割 tRNA 前體兩端且 tRNA 大量存在于細(xì)胞中，基于以上這些特點(diǎn)研究人員將 tRNA 與 gRNA 結(jié)合起來(lái)，合成一個(gè)多順?lè)醋踊?PTG，將多個(gè) sgRNA 與 tRNA 串聯(lián)在同一表達(dá)載體上(Xie et al.，2015)（圖 1-3）。研究顯示，內(nèi)源 tRNA 加工系統(tǒng)能夠精確加工這個(gè)合成基因，有效生成大量攜帶正確靶向序列的 gRNA，引導(dǎo) Cas9 編輯多個(gè)目標(biāo)染色體。這一策略能夠在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因水稻中高效（高達(dá) 100%）實(shí)現(xiàn)多重基因組編輯和染色體片段的刪除(Xie et al.，2015)。此后，tRNA-sgRNA 這套系統(tǒng)還成功應(yīng)用于敲除與玉米(Qi et al.，2016)、小麥(Wang et al.，2016)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因，顯著提高了 CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重編輯效率，極大程度促進(jìn)作物遺傳及品種改良等研究。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于SRK基因序列分析的甘藍(lán)自交不親和系單倍型鑒定及驗(yàn)證[J]. 鄭敏,朱陳曾,劉夢(mèng)慈,徐冰冰,馬存發(fā),李勤菲,任雪松,司軍,宋洪元.  中國(guó)蔬菜. 2018(03)
[2]兩種密碼子優(yōu)化的Cas9編碼基因在斑馬魚(yú)胚胎中基因敲除效率的比較[J]. 張峰華,王厚鵬,黃思雨,熊鳳,朱作言,孫永華.  遺傳. 2016(02)
[3]CRISPR/Cas9的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 鄭武,谷峰.  遺傳. 2015(10)
[4]辣椒雄性不育系及保持系小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)比較[J]. 王蘭蘭,王曉林,魏兵強(qiáng),陳靈芝,張茹.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2015(01)
[5]水稻隱性核雄性不育基因研究進(jìn)展及育種應(yīng)用探討[J]. 馬西青,方才臣,鄧聯(lián)武,萬(wàn)向元.  中國(guó)水稻科學(xué). 2012(05)
[6]甘藍(lán)胞質(zhì)雄性不育系CMS158小孢子發(fā)生的細(xì)胞學(xué)研究[J]. 許忠民,張恩慧,程永安,鞏振輝,馬青山.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(03)
[7]兩種甘藍(lán)Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育源的分子鑒別[J]. 張揚(yáng)勇,方智遠(yuǎn),王慶彪,劉玉梅,楊麗梅,莊木,孫培田.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(14)
[8]甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料分子鑒定及花器官形態(tài)對(duì)核背景的響應(yīng)[J]. 張艷,王小佳,李成瓊,宋洪元,任雪松,司軍.  園藝學(xué)報(bào). 2010(06)
[9]甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型的分子鑒定[J]. 陳燁麗,陳學(xué)好,陳錦秀,繆體云,薄天岳.  上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2009(03)
[10]蕓薹屬自交不親和功能因子及分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 盧軍,李樂(lè)玉,陳曉丹,朱利泉,王小佳.  廣西農(nóng)業(yè)科學(xué). 2007(06)

博士論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點(diǎn)編輯研究[D]. 朱金潔.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]四種類型甘藍(lán)雄性不育系花藥敗育特征及基因表達(dá)譜分析[D]. 康俊根.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2006

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯甘藍(lán)基因的初步研究[D]. 馬存發(fā).西南大學(xué) 2017
[2]擬南芥ms1回復(fù)突變篩選及基因定位[D]. 李亞?wèn)|.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016



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