文昌魚具有獨特的進化地位以及形態(tài)結(jié)構(gòu)和基因組的簡單性,因此是很好的進化發(fā)育生物學(xué)研究的模式動物。近年來,實驗室連續(xù)繁育、誘導(dǎo)產(chǎn)卵、顯微注射、基因敲除等技術(shù)的建立使得文昌魚模型愈趨成熟。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是重要的基因功能研究手段,但目前尚未有轉(zhuǎn)基因文昌魚的報道。Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一個比較高效的轉(zhuǎn)基因工具,它能夠攜帶10kp以上的目的片段轉(zhuǎn)座到宿主基因組中,且已有研究證明該系統(tǒng)在諸多脊椎動物模型中有很好的工作效率。為了在文昌魚中建立Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù),本研究分別將斑馬魚（Danio rerio）的 mylz2 基因啟動子和文昌魚（Branchiostomafloriaae）的Chordin基因啟動子與紅色熒光蛋白（RFP）報告基因mCherry一起組裝到pminiTol2質(zhì)粒上構(gòu)建成兩個轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pmini-mylz2-mCherry和pmini-Chordin-mCherry。將這兩個供體質(zhì)粒分別與體外合成的轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射到文昌魚（B.floridae）的未受精卵中,在受精后的胚胎中即檢測到很強的RFP信號。將注射后的胚胎培育成性成熟個體（FO）并與野生型個體（WT）... 

【文章來源】：廈門大學(xué)福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２?７ｂ／２元件的切除反應(yīng)示意圖（仿自Ｋａｗａｋａｍｉ，?Ｋｏｇａｄａ／．?１９９８Ｐ６］）??Ｆｉｇ．１－２?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｃｉｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｔｏｌ２?ｅｌｅｍｅｎｔ?ｆｒｏｍ?ｐＴｏｌ２??

Ａ?Ｔｏｌ２?ｐｌａｓｍｉｄ??ｉ?－ｊ??圖１－２?７ｂ／２元件的切除反應(yīng)示意圖（仿自Ｋａｗａｋａｍｉ，?Ｋｏｇａｄａ／．?１９９８Ｐ６］）??Ｆｉｇ．１－２?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｃｉｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｔｏｌ２?ｅｌｅｍｅｎｔ?ｆｒｏｍ?ｐＴｏｌ２??黑色曲線表示質(zhì)粒序列；黑色箭頭表示用于檢測切除反應(yīng)的ＰＣＲ引物；折線表示被刪除的??開放閱讀框區(qū)段。??Ｂｌａｃｋ?ｃｕｒｖｅｓ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ．?Ｂｌａｃｋ?ａｒｒｏｗｓ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ａ?ｐａｉｒ?ｏｆ?ｐｒｉｍｅｒ?ｕｓｅｄ?ｔｏ?ｔｅｓｔ?ｅｘｃｉｓｉｏｎ；??ｂｒｏｋｅｎ?ｌｉｎｅ?ｒｅｆｅｒｓ?ｔｏ?ｄｅｌｅｔｅｄ?ｓｅｇｍｅｎｔ?ｏｆ?ＯＲＦ．??ｆ＾?讀?＞??Ａ?Ｔｏｌ２?ｐｌａｓｍｉｄ??ｖ?／??Ｃｏ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ?ｗｉｔｈ?ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ?ｍＲＮＡ?Ｉ??ｉｎｔｏ?ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ?ｅｇｇｓ??？??／＊?＼??ｅｘｃｉｓｉｏｎ??Ｖ?Ｖ??Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ?ｉｎｔｏ?ｚｅｂｒａｆｉｓｈ?ｇｅｎｏｍｅ??圖１－３?７ｂ／２系統(tǒng)在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)座作用（仿自Ｋａｗａｋａｍｉ?ａｎｄ?Ｓｈｉｍａ?１９９９?［３７］??ａｎｄ?Ｋａｗａｋａｍｉ，?Ｓｈｉｍａ?ｅｔ?ａｌ．?２０００［３８］）??Ｆｉｇ．１－３?ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｔｏｌ２?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｚｅｂｒａｆｉ

ａ?ｎｅｗ?８－ｂｐ?ｄｉｒｅｃｔ?ｒｅｐｅａｔｓ?ｉｎ?ｚｅｂｒａｆｉｓｈ?ｇｅｎｏｍｅ?ｎｅａｒ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ?Ｔｏｌ２?ｅｌｅｍｅｎｔ．??１９９８年Ｋａｗａｋａｍｉ等將帶有完整７ｂ／２元件的質(zhì)粒（７ｂ／２ｐｌａｓｍｉｄ簡稱ｐＴｏｌ２，??圖１－２）以及部分開放閱讀框缺失的２ｂ／２元件的質(zhì)粒（Ａ７ｂ／２?ｐｌａｓｍｉｄ簡稱ｐＡ??Ｔ〇１２，圖１－２）分別注射到斑馬魚的受精卵中，然后用ＰＣＲ以及??測序的方法檢測元件在質(zhì)粒上的切除反應(yīng)（ｅｘｃｉｓｉｏｎ，“ｃｕｔ－ａｎｄ－ｐａｓｔｅ”機制??轉(zhuǎn)座作用的第一步），結(jié)果７ｂ／２元件能從注射的ｐＴ〇１２上切除但是不能從注射的??ｐＡＴｏｌ２上切除（圖１－２）?［３６］。這表明７ｂ／２轉(zhuǎn)座子是自主型的轉(zhuǎn)座子，即它的開??放閱讀框編碼了一個活性的轉(zhuǎn)座酶。??隨后Ｋａｗａｋａｍｉ等鑒定了?Ｔｏｌ２轉(zhuǎn)座酶的編碼序列，并且將其完整的ｃＤＮＡ??序列克隆到體外的表達(dá)載體上以進行體外轉(zhuǎn)錄。當(dāng)體外轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)座酶ｍＲＮＡ和??ｐＡＴｏｌ２共注射到斑馬魚受精卵后，７ｂ／２元件能夠從ｐＡＴｏｌ２上被切除（圖１－３）??［３７］。這表明轉(zhuǎn)座酶確實能夠催化７ｂ／２元件的切除反應(yīng)（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）。后續(xù)的研究??表明體外轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)座酶ｍＲＮＡ和ｐＡＴｏｌ２的共注射能夠使７ｂ／２元件整合??（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，“ｃｕｔ－ａｎｄ－ｐａｓｔｅ”機制轉(zhuǎn)座作用的第二步）到斑馬魚的基因組中，且??在宿主的靶位點產(chǎn)生ｈＡＴ轉(zhuǎn)座子家族特異的８－ｂｐ正向重復(fù)序列（圖１－３）?［３８］。??因此


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