CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)成為生物研究中不可或缺的工具之一。至今為止,CRISPR-Cas9不再僅僅是一種基因編輯工具,它的應(yīng)用領(lǐng)域范圍擴展到基因調(diào)控、表觀遺傳編輯、染色質(zhì)工程和成像等方面,已遠遠超過了野生型（WT）Cas9本身的基因編輯功能。CRISPR相關(guān)新技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用將是未來研究的熱點問題。本研究主要是應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)相關(guān)新技術(shù)在小鼠細胞、胚胎及人的胚胎中對靶基因進行基因編輯,從而探討這些新技術(shù)是否能安全、有效的應(yīng)用于遺傳疾病治療。首先,本研究通過在小鼠細胞中比較CasRx系統(tǒng)抑制NHEJ途徑重要因子Lig4并結(jié)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)及Cas9-ORF52蛋白（Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹ORF52蛋白）共表達這兩種策略對同源重組效率的影響,證明這兩種方法均能顯著的提高同源重組的效率,為在臨床疾病治療中實現(xiàn)需要定向堿基插入或靶向點突變的精確基因組編輯應(yīng)用提供了新的策略。其次,應(yīng)用BE3堿基編輯系統(tǒng),即Crispr-stop新技術(shù)對小鼠體內(nèi)3個基因單獨或同時進行敲除,旨在可以在F0代中產(chǎn)生直接用于分析的單個或三個純合突變小鼠,避免繁瑣的小鼠繁殖過程并能使研究小鼠基因功... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：143 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

基于CRYSPR-CAS技術(shù)的基因組編輯技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域[62]

隦NA。該研究證明，能夠在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中使用內(nèi)源性神經(jīng)原性基因的靶向激活，以直接和有效地將星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為體內(nèi)功能性神經(jīng)元。該系統(tǒng)提供靈活，快速的篩選平臺，用于研究哺乳動物大腦中的復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)和功能獲得表型[127]。誘導(dǎo)內(nèi)源基因座的表達與外源表達相比具有許多優(yōu)點。對來自靶基因座的基因表達動力學(xué)的精確空間和時間控制具有很大的治療潛力。CRISPR方法的靈活性使研究人員能夠采用各種方法來實現(xiàn)這一目標(biāo)。通過光遺傳學(xué)和小分子靶向的誘導(dǎo)型CRISPR是CRISPR介導(dǎo)的基因表達方法中更顯著的進步之一[128-131]。圖1-3通過CRISPR-CAS系統(tǒng)招募DNA和染色質(zhì)靶向和修飾酶的主要策略[62]Fig.1-3MajorstrategiestorecruitDNA-andchromatin-targetingandmodifyingenzymesviatheCRISPR-Cassystem.1.6.3CRISPR介導(dǎo)的表觀基因組編輯的發(fā)展與應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為有效的基因編輯系統(tǒng)后，研究人員便開始利用dCas9融合各種表觀遺傳學(xué)因子對特定基因進行表觀遺傳學(xué)方面的修飾。目前來講，“表觀遺傳學(xué)”的定義還是一個有爭議的問題。在這里，我們使用“表觀遺傳”這個詞來暗示可遺傳基因表達變化的分子機制，這種變化不能歸因于DNA序列的變化。與表觀機制的表觀遺傳學(xué)不同，表觀基因組描述了與基因組中調(diào)控元件相關(guān)的所有翻譯后修飾和其他染色質(zhì)特征。最近的大規(guī)模表觀基因組學(xué)研究，如ENCODE和REMC已經(jīng)在各種細胞系以及原代細胞類型和組織中對基因組DNA和組蛋白上的染色質(zhì)修飾進行了定位[132,133]。盡

廣西大學(xué)博士學(xué)位論文CRISPR基因編輯相關(guān)新技術(shù)的優(yōu)化與完善研究31圖2-2小鼠Actb、Tubb3位點測序圖Figure2-2.GenotypinganalysisofcellsatActb、Tubb3lociinN2AandE14cells將小鼠細胞進行消化收集，使用血液、組織、細胞基因組提取試劑盒（天根）抽取基因組，具體步驟如下：將小鼠N2A細胞消化制成細胞懸液，然后12000rpm離心1min，用移液槍吸取上清，加200μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸��；加入20μlProteinaseK溶液置水浴鍋56℃反應(yīng)30min；之后加入200μlGB緩沖液，混勻后放入70℃水浴10min，直至溶液應(yīng)變清亮為止短暫離心數(shù)秒；加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15sec短暫離心數(shù)秒以去除管蓋內(nèi)壁的水珠后，將溶液全部倒入一個吸附柱CB3中，12000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；加入500μl緩沖液GD，12000rpm離心30sec，丟棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μlPW漂洗液，12,000rpm離心30sec，丟棄廢液后，將吸附柱CB3放入收集管中，再重復(fù)此步驟一次；將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，使收集管中殘余的漂洗液揮發(fā)；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μlddH2O，室溫放置2min，12,000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中并進行定量。然后使用TAKALAPremixExTaqPCR分別檢測插入的Actb、Tubb3位點，然后使用PCR產(chǎn)物直接測序。PCR引物見附錄1。PCR組分如下：表2-9小鼠基因型檢測PCR組分Table2-9ThePCRcomponentsformousegenotyping試劑使用量PremixTaq基因組DNAPrimerActborTubb3AF/BF（10μm）PrimerActborTubb3AR/BR（10μm）ddH2OTotal12.5μl1μl1μl1μl11.5μl25μl巣式反應(yīng)第一輪：95


本文編號：3301480