鈣信號是植物生長發(fā)育和響應環(huán)境變化過程中的核心傳感器和調節(jié)器。而我們對鈣信號傳導潛在機制的理解以及對其參與細胞眾多進程的認識,很大程度上依賴于鈣指示劑的發(fā)展。因此,高空間分辨率和時間分辨率的鈣指示劑對于監(jiān)測鈣動態(tài)變化具有非常重要的意義。在本研究中,我們以植物鈣信號研究中最新的超靈敏鈣指示劑GCaMP6S為基礎,將其進一步優(yōu)化。通過將GCaMP6S與不同信號肽融合,同時利用能夠在后代中能夠穩(wěn)定高效表達且不容易出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象的UBIQUITIN10（UBQ10）作為啟動子驅動表達,我們構建了一系列能夠進行亞細胞定位的原生質體瞬時表達載體以及能夠在模式植物擬南芥中穩(wěn)定表達的植物表達載體。借助引入鈣離子（Ca2+）非敏感性蛋白的dTomato作為定量蛋白,我們開發(fā)出了能夠進行鈣離子定量成像的熒光比率型指示劑GCaMP6S-dTomato。為了能夠在植株水平或組織器官水平研究鈣信號相關事件,我們獲得了一系列超靈敏鈣指示劑的轉基因植物。前人的研究表明,硝酸鹽能夠誘導擬南芥胞質中鈣離子濃度快速升高,因此利用該已知信號,我們證明了融合了紅色熒光蛋白的比率型指示劑GCaMP6S-dTomato具有與G... 

【文章來源】：福建農林大學福建省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１基于熒光強度的瞬時表達載體構建圖譜??基于熒光強度的瞬時表達載體：該圖中灰色箭頭表示川啟動子，綠色方塊表示超靈敏??

精度上精確監(jiān)測植物細胞中鈣離子濃度的動態(tài)變化�；跓晒夤舱衲芰哭D移的比??率型Ｃａ２＋指示劑ｃａｍｅｌｏｎ系列由于自身的不足，限制了其在植物中的深入應用。??因此我們嘗試進一步優(yōu)化基于ＧＣａＭＰ６Ｓ的超靈敏鈣指示劑，如圖３－２所示，通??過融合鈣離子不敏感蛋白ｄＴｏｍａｔｏ，測量綠色和紅色熒光的比率即可定量細胞內??鈣離子濃度。即使低鈣離子濃度或無鈣離子的情況下，我們仍然可以檢測到紅色??熒光，這將有助于研究者對鈣離子變化有更細微且精確的了解，進一步探入對鈣??信號分子機制的破解。???１?ＵＢ〇１〇Ｖ￣?ＧＣａＭＰ６Ｓ?八?ｄＴｏｍａｔｏ?ｎｏｓ〉???１?ＮＬＳ?｜???｜ＵＢＱ１Ｑ＾￣?ＧＣａＭＰ６Ｓ?Ｉｔ?ｄＴｏｍａｔｏ?ｔ????ｐＭ，?｜?Ｌｉｎｋｅ）?｜??Ｉ?ＴＰ?Ｉ??圖３－２基于熒光比率的瞬時表達載體構建圖譜??基于熒光強度的瞬時表達載體：該圖中灰色箭頭表示啟動子，綠??色方塊表示超靈敏鈣指示劑ＧＣａＭＰ６Ｓ，紫色箭頭表示ｎｏｓ終止子，藍色小方塊表示連接兩??個熒光蛋白的接頭序列

ＰＧ／／５－Ｐ３５＆Ｌ／Ｃ－ＭＷ？連接通過農桿菌侵染的方法導入到擬南芥基因??組ＤＮＡ中，再通過該植物表達載體賦予植物的相應抗性篩選得到純合轉基因植??物。構建的植物雙元表達載體的簡易圖譜如


本文編號：3300601