鈣信號是植物生長發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境變化過程中的核心傳感器和調(diào)節(jié)器。而我們對鈣信號傳導(dǎo)潛在機制的理解以及對其參與細(xì)胞眾多進(jìn)程的認(rèn)識,很大程度上依賴于鈣指示劑的發(fā)展。因此,高空間分辨率和時間分辨率的鈣指示劑對于監(jiān)測鈣動態(tài)變化具有非常重要的意義。在本研究中,我們以植物鈣信號研究中最新的超靈敏鈣指示劑GCaMP6S為基礎(chǔ),將其進(jìn)一步優(yōu)化。通過將GCaMP6S與不同信號肽融合,同時利用能夠在后代中能夠穩(wěn)定高效表達(dá)且不容易出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象的UBIQUITIN10（UBQ10）作為啟動子驅(qū)動表達(dá),我們構(gòu)建了一系列能夠進(jìn)行亞細(xì)胞定位的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)載體以及能夠在模式植物擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)的植物表達(dá)載體。借助引入鈣離子（Ca2+）非敏感性蛋白的dTomato作為定量蛋白,我們開發(fā)出了能夠進(jìn)行鈣離子定量成像的熒光比率型指示劑GCaMP6S-dTomato。為了能夠在植株水平或組織器官水平研究鈣信號相關(guān)事件,我們獲得了一系列超靈敏鈣指示劑的轉(zhuǎn)基因植物。前人的研究表明,硝酸鹽能夠誘導(dǎo)擬南芥胞質(zhì)中鈣離子濃度快速升高,因此利用該已知信號,我們證明了融合了紅色熒光蛋白的比率型指示劑GCaMP6S-dTomato具有與G... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１基于熒光強度的瞬時表達(dá)載體構(gòu)建圖譜??基于熒光強度的瞬時表達(dá)載體：該圖中灰色箭頭表示川啟動子，綠色方塊表示超靈敏??

精度上精確監(jiān)測植物細(xì)胞中鈣離子濃度的動態(tài)變化�；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移的比??率型Ｃａ２＋指示劑ｃａｍｅｌｏｎ系列由于自身的不足，限制了其在植物中的深入應(yīng)用。??因此我們嘗試進(jìn)一步優(yōu)化基于ＧＣａＭＰ６Ｓ的超靈敏鈣指示劑，如圖３－２所示，通??過融合鈣離子不敏感蛋白ｄＴｏｍａｔｏ，測量綠色和紅色熒光的比率即可定量細(xì)胞內(nèi)??鈣離子濃度。即使低鈣離子濃度或無鈣離子的情況下，我們?nèi)匀豢梢詸z測到紅色??熒光，這將有助于研究者對鈣離子變化有更細(xì)微且精確的了解，進(jìn)一步探入對鈣??信號分子機制的破解。???１?ＵＢ〇１〇Ｖ￣?ＧＣａＭＰ６Ｓ?八?ｄＴｏｍａｔｏ?ｎｏｓ〉???１?ＮＬＳ?｜???｜ＵＢＱ１Ｑ＾￣?ＧＣａＭＰ６Ｓ?Ｉｔ?ｄＴｏｍａｔｏ?ｔ????ｐＭ，?｜?Ｌｉｎｋｅ）?｜??Ｉ?ＴＰ?Ｉ??圖３－２基于熒光比率的瞬時表達(dá)載體構(gòu)建圖譜??基于熒光強度的瞬時表達(dá)載體：該圖中灰色箭頭表示啟動子，綠??色方塊表示超靈敏鈣指示劑ＧＣａＭＰ６Ｓ，紫色箭頭表示ｎｏｓ終止子，藍(lán)色小方塊表示連接兩??個熒光蛋白的接頭序列

ＰＧ／／５－Ｐ３５＆Ｌ／Ｃ－ＭＷ？連接通過農(nóng)桿菌侵染的方法導(dǎo)入到擬南芥基因??組ＤＮＡ中，再通過該植物表達(dá)載體賦予植物的相應(yīng)抗性篩選得到純合轉(zhuǎn)基因植??物。構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體的簡易圖譜如


本文編號：3300601