番茄是一種冷敏型植物,無論植株生長發(fā)育還是采后番茄果實(shí)運(yùn)輸或貯藏,都極易受到低溫的傷害。MAPK家族基因是植物抗冷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因,MAPK級(jí)聯(lián)途徑是植物抗冷調(diào)控過程中的重要環(huán)節(jié)。本文以“麗春”番茄為實(shí)驗(yàn)材料,結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因理論,采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),嘗試培育SlMAPK4基因突變番茄植株,并探究SlMAPK4基因敲除對番茄果實(shí)抗冷性的影響。本文主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:（1）在5’端ORF區(qū)以及基因外顯子功能結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建了1個(gè)靶點(diǎn)位。后對靶點(diǎn)序列在SlMAPK4基因座中的位置進(jìn)行分析,驗(yàn)證了兩靶點(diǎn)均處于外顯子序列中。（2）根據(jù)靶接頭設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)出了第一輪Overlapping PCR所需引物,后經(jīng)二輪PCR,完成了sgRNA表達(dá)盒BsaⅠ酶切位點(diǎn)的添加。經(jīng)pYLCRISPR/Cas9-SlMAPK4載體測序及農(nóng)桿菌菌落PCR驗(yàn)證,證實(shí)pYLCRISPR/Cas9-SlMAPK4載體成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌基因組中。（3）經(jīng)過PHT（潮霉素）基因的PCR檢測,共獲得陽性植株40棵,經(jīng)測序T₀代的打靶率在70%左右。據(jù)T₁

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

MAPK級(jí)聯(lián)介導(dǎo)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑（Ichimuraetal.,1998）

vtunetal.,2000）。擬南芥ROS清除酶系統(tǒng)非常復(fù)雜，由15個(gè)基因家族共148個(gè)基因進(jìn)行編碼（Mittleretal.,2004），9個(gè)基因家族23個(gè)基因表達(dá)在mekk1、mapkk1/2和mapk4突變?nèi)笔椭曛惺艿揭种谱饔茫≒itzschkeetal.,2009）。擬南芥mekk1、mapkk1/2和mapk4突變體植株，負(fù)責(zé)類囊體過氧化物酶（thylakoidalperoxidase,tAPX）和過氧化氫酶（catalase,CAT）的編碼基因表達(dá)會(huì)受到抑制（Yoshiokaetal.,2003）。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥H2O2發(fā)生積累時(shí)，MAPK生物活性被激活，同時(shí)可正調(diào)控抗性基因GST6和HSP18.2的表達(dá)（Kovtunetal.,2000）。圖1-2MAPK級(jí)聯(lián)響應(yīng)非生物脅迫下ROS信號(hào)（Kovtunetal.,2000）Fig1-2MAPKcascadesrespondtotheresultingoxidativeburstandmayregulateROSaccumulation

SlMAPK4基因敲除對番茄果實(shí)抗冷性的影響10于野生型植株（Jaglo-Ottosenetal.,1998）。CBF基因的抗冷能力較大程度取決與其對下游抗凍蛋白基因表達(dá)的調(diào)控。CBF蛋白含有AP2/DNA結(jié)合域，可與下游基因啟動(dòng)子CRT/DRE元件結(jié)合，并對其表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控（Medinaetal.,1999）。目前所發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子中含有CRT/DRE元件的基因有：COR15a、COR47/RD17、COR78/RD29A、COR6.6/KIN2、KIN1，其中對COR15a研究最為深入。COR15a的功能定位在葉綠體機(jī)制上，其肽鏈存在α-螺旋，具有親水性，可改變?nèi)~綠體被膜折疊以推遲六邊形堆積結(jié)構(gòu)體的形成，具有保護(hù)葉綠體和原生質(zhì)體，提高抗冷脅迫能力的作用。（Jaglo-Ottosenetal.,1998；Zhangetal.,2004）。Zhao等構(gòu)建了擬南芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3三個(gè)基因突變體植株，在低溫脅迫條件下，RD29A、COR15a、KIN1、及COR47的基因表達(dá)量明顯下降（Zhaoetal.,2016）。Zhang等研究表明番茄中具有完整的CBF冷應(yīng)答途徑，但番茄中CBF下游基因家族較擬南芥明顯減少。擬南芥中研究較為透徹的COR基因家族在番茄中無法找到。通過構(gòu)建番茄SlCBF1及SlCBF3超表達(dá)植株，研究發(fā)現(xiàn)SlCBF3超表達(dá)植株其下游cLER1P6、cLER17C11、cLET13N19和cSlR1E13基因表達(dá)量高于對照的2.5倍（Zhangetal.,2004）。趙（2009）也進(jìn)一步驗(yàn)證在番茄中，cSlR1P6及cSlR17C11受低溫脅迫伴隨SlCBF1的表達(dá)而表達(dá)，推測cLER1P6和cLER17C11為番茄SlCBF1下游基因，與擬南芥中COR基因家族的功能相似。圖1-3CBF抗冷信號(hào)途徑的組成模式（Chinnusamyetal.,2003）Fig.1-3CBFcoldsignaltransductionpathway

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]系統(tǒng)Ⅱ乙烯對采后番茄果實(shí)抗冷過程中抗氧化酶的影響[J]. 呂勝男,趙瑞瑞,申琳,趙丹瑩,生吉萍.  食品科學(xué). 2012(08)
[2]脯氨酸與植物抗寒性的研究進(jìn)展[J]. 王小華,莊南生.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2008(11)
[3]H2O2參與冷激處理對番茄果實(shí)抗冷性及抗氧化酶活性的影響[J]. 歐陽麗喆,申琳,陳海榮,范蓓,鄭楊,孫建軍,生吉萍.  食品科學(xué). 2007(07)
[4]10℃低溫對綠豆和豌豆下胚軸細(xì)胞一些抗氧化酶活性和超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 陳旭微,楊玲,章藝,鞏菊芳.  植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào). 2005(05)
[5]幾種外源物質(zhì)提高植物抗冷力的生理機(jī)制[J]. 康國章,王正詢,孫谷疇.  植物生理學(xué)通訊. 2002(02)
[6]水分脅迫對芒果（Mangifera indica L.）幼葉細(xì)胞活性氧傷害的影響[J]. 陳由強(qiáng),朱錦懋,葉冰瑩.  生命科學(xué)研究. 2000(01)
[7]氮藍(lán)四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶活性的適宜條件[J]. 沈文飚,徐朗萊,葉茂炳,張榮銑.  南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 1996(02)



本文編號(hào)：3287725