胞苷是核苷酸類保健食品和功能性食品的原料之一,也是合成多種抗病毒、抗腫瘤藥物的中間體,主要通過微生物直接發(fā)酵法獲得。菌體細胞膜對發(fā)酵過程中胞苷的分泌有重要影響。本文以解淀粉芽孢桿菌BG-09和大腸桿菌BG-12為研究對象,對細胞膜滲透性相關的基因psd和不同的表面活性劑進行研究,分別分析了同源和異源過量表達psd基因對胞苷發(fā)酵的影響,探討了ps 基因在胞苷分泌過程中的作用;在大腸桿菌BG-12發(fā)酵過程中添加4種不同表面活性劑,研究其對胞苷發(fā)酵和細胞膜滲透性的影響。主要研究內容的結果如下:1.psd基因過量表達載體的構建。通過途徑分析,發(fā)現解淀粉芽孢桿菌中磷脂酰絲氨酸脫竣酶（EC:4.1.1.65,由psd基因編碼）與菌體細胞膜磷脂合成密切相關。以解淀粉芽孢桿菌BG-09基因組DNA為模板,擴增psd基因,連接到質粒pHT43中,經酶切驗證與電泳分析可知,構建成功,獲得重組表達載體pHT43-ppsd。2.過表達psd基因對解淀粉芽孢桿菌BG-09胞苷發(fā)酵的影響。將構建的重組表達載體pHT43-psd電轉化至Bacillus amyloliquefaciens BG-09 中,獲得重組菌... 

【文章來源】：寧夏大學寧夏回族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數】：75 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２甘油磷脂代謝途徑［４７］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ?ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??細?

圖１－３過量表達技術路線圖??Ｆｉｇ．?１－３?Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?Ｒｏａｄｍａｐ??表面活性劑對胞苷發(fā)酵的影響的技術路線圖如圖１－４所示。??ｒ?Ｘ?／＊????＇??Ｓ??大腸桿菌ＢＧ－１２??？表面活性劑??Ｖ?－????Ｖ?－Ｊ??／?Ｎ????＼??測定菌體生長、耗糖速率及胞苷濃度?Ｔｗｅｅｎ－８０．?ＨｉｔｏｎＸ－ｌＯＯ．?Ｃ＇ＴＡＢ．?ＥＭＢ??Ｊ????１?，??分析添加不同表面活性劑對大腸桿菌ＢＧ－１２??胞苷發(fā)酵及細胞膜滲透性的影響??Ｖ－??．．．．?＾??圖１－４表面活性劑對胞苷發(fā)酵影響的技術路線圖??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ?Ｒｏａｄｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ?ｏｎ?Ｃ＞ｔｉｄｉｎｅ?Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ??－８－??

注：Ｍ．ＤＬｌＯＯＯＯＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１、２：ＰＣＲ?擴增產物?注：Ｍ．ＤＬ１００００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１、２：ＰＣＲ?擴增產物回收??圖２－１目的片段的ＰＣＲ擴增結果?圖２－２目的片段ＰＣＲ純化回收??Ｆｉｇ．?２－１?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔａｒｇｅｔ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?Ｆｉｇ．?２－２?Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ａｎｄ?Ｒｅｃｏｖｅｒｙ?ｏｆ?Ｔａｒｇｅｔ?ｂｙ?ＰＣＲ??（２）?ＴＡ克隆載體鑒定??將ＰＣＲ擴增目的片段純化回收，取回收產物克隆在ｐＭＤ１９－Ｔ?Ｖｅｃｔｏｒ上并轉化至五．ｃｏｈ??ＤＨ５ａ感受態(tài)細胞中，涂布于含有Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的ＬＢ固體培養(yǎng)基中，ＴＡ克隆菌落如圖??２－３所示，圖中出現較多白斑，說明有假陽性出現，挑取克隆菌落分別逐一進行菌落ＰＣＲ鑒??定，結果如圖２－４表明，擴增產物大小在８８４ｂｐ左右的即與目標條帶大小一致，可初步鑒定為陽??性克隆菌株。??圖２－３?ＴＡ克隆菌落形態(tài)??Ｆｉｇ．?２－３?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＴＡ?ｃｌｏｎｅ??ｉｊ＾Ｈ??注：Ｍ．ＤＬ１００００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１？２４：陽性菌落擴增產物，其中１９條帶不正確??圖２－４重組質粒ＴＡ－＿ｐｓｄ菌落ＰＣＲ鑒定結果??Ｆｉｇ．?２－４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｐｌ


本文編號：3283191