他克莫司（FK506）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種23元大環(huán)內酯類免疫抑制劑,是肝和腎等器官移植后抗排斥反應的一線用藥,已在多個國家上市。然而作為一種微生物的發(fā)酵產(chǎn)物,FK506存在效價低、副產(chǎn)物多等問題。因此,通過研究其產(chǎn)生菌中影響FK506生物合成的相關基因,能夠為通過基因工程改善該菌的發(fā)酵特性、降低生產(chǎn)成本等創(chuàng)造有利條件。本研究以鏈霉菌Streptomyces sp.TL01為出發(fā)菌株,研究了FK506生物合成及其轉錄調控因子編碼基因、次級代謝相關基因以及外源的顫血紅蛋白編碼基因分別對菌株發(fā)酵和代謝產(chǎn)物生物合成的影響。以LuxR家族的轉錄調控因子編碼基因fkbN, LysR家族的轉錄調控因子編碼基因tcs7,初級代謝途徑中參與合成或消耗NADPH的酶編碼基因zwf2和gltD,催化乙酰CoA生成丙二酰CoA的酶編碼基因bccA2,催化他克莫司生物合成后修飾的C31位氧甲基化酶編碼基因fkbM,及用于提高菌株氧結合水平的顫血紅蛋白編碼基因vgb等作為目標基因,借助分子生物學的手段,通過酶切酶連完成重組質粒構建后,經(jīng)大腸桿菌-鏈霉菌的屬間接合轉移,將構建好的質粒導入到受體菌Streptomy... 

【文章來源】：福建中醫(yī)藥大學福建省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表
前言
第一章 材料與方法
    1 材料、試劑和儀器
        1.1 菌種
        1.2 質粒
        1.3 PCR引物
        1.4 培養(yǎng)基
        1.5 試劑
        1.6 儀器和設備
    2 實驗方法
        2.1 菌種的分離純化
        2.2 FK506發(fā)酵和液相分析
        2.3 菌種保藏
        2.4 抗生素敏感性實驗
        2.5 鏈霉菌基因組DNA的提取
        2.6 PCR反應體系和程序
        2.7 瓊脂糖凝膠電泳
        2.8 DNA片段的膠回收和PCR純化
        2.9 大腸桿菌質粒的提取
        2.10 DNA酶切、去磷酸化和酶連
        2.11 大腸桿菌質粒轉化
        2.12 大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉移
        2.13 敲除菌株的篩選
        2.14 PCR驗證
第二章 轉錄調控因子編碼基因對FK506合成的影響研究
    1 基因改造
        1.1 PCR引物設計
        1.2 PCR擴增
        1.3 質粒構建
        1.4 工程菌構建
    2 發(fā)酵與液相分析
        2.1 fkbN改造菌株的發(fā)酵和液相分析
        2.2 tcs7改造菌株的發(fā)酵和液相分析
    3 討論
第三章 初級代謝基因對FK506合成的影響研究
    1 基因改造
        1.1 PCR引物設計
        1.2 PCR擴增
        1.3 質粒構建
        1.4 工程菌構建
    2 發(fā)酵與液相分析
        2.1 zwf2、6ccA2基因增加拷貝數(shù)工程菌株的發(fā)酵和液相分析
        2.2 gltD改造菌株的發(fā)酵和液相分析
    3 討論
第四章 FK506生物合成基因的功能研究
    1 基因改造
        1.1 PCR引物設計
        1.2 PCR擴增
        1.3 質粒構建
        1.4 工程菌構建
    2 發(fā)酵與液相分析
        2.1 fkbM基因增加拷貝數(shù)工程菌株的發(fā)酵和液相分析
    3 討論
第五章 外源顫血紅蛋白基因對他克莫司產(chǎn)生菌生長影響
    1 基因改造
        1.1 質粒構建
        1.2 工程菌構建
    2 發(fā)酵分析
    3 討論
第六章 結論
    1 轉錄調控因子編碼基因對FK506合成的影響研究
    2 初級代謝基因對FK506合成的影響研究
    3 FK506生物合成基因的功能研究
    4 外源顫血紅蛋白基因對他克莫司產(chǎn)生菌生長影響
    5 討論與展望
參考文獻
致謝
文獻綜述
    1 他克莫司產(chǎn)生菌
    2 他克莫司生物合成機制
        2.1 骨架的合成
        2.2 特殊前體的合成
        2.3 結構后修飾
    3 他克莫司發(fā)酵營養(yǎng)學與菌種改造
        3.1 合成前體物對發(fā)酵水平的影響
        3.2 遺傳改造
    4 發(fā)酵產(chǎn)物純化
    5 總結和展望
    參考文獻
作者簡歷



本文編號：3268214