自轉基因作物商業(yè)化應用以來,耐除草劑一直是轉基因作物的主要性狀,2019年耐除草劑轉基因作物的種植面積占全球轉基因作物種植面積的46%。轉基因耐除草劑作物的大面積種植帶來了巨大的經濟和社會效益,但草甘膦抗性雜草的出現(xiàn)也引起了人們對其產生的環(huán)境風險的廣泛關注�；虿鸱旨夹g培育的轉基因作物能夠很好的避免目標性狀逃逸到環(huán)境中所帶來的影響,是防控基因飄流和防止耐草甘膦雜草產生的有效措施。為了利用基因拆分技術培育aroA_A1501基因耐草甘膦水稻,本研究通過結構分析法篩選基因的可拆分位點,并通過功能互補試驗獲得基因的可拆分位點,通過原核系統(tǒng)分析比較不同位點拆分后,在intein介導下重新組裝蛋白的草甘膦耐受性及酶動力參數,獲得適宜的可拆分位點,研究結果為利用基因拆分技術培育耐草甘膦的轉基因水稻提供技術支撐,同時為利用基因拆分技術防控基因飄流、預防耐草甘膦雜草產生提供技術儲備。具體研究結果如下:1)生物信息學分析預測aroA_A1501基因編碼的EPSPS蛋白的一級結構、二級結構和三級結構,根據蛋白結構預測出了13個可能拆分的位點。利用PCR的方法將aro... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數】：95 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

莽草酸合成途徑和草甘膦作用位點（GOMESetal.,2014）

016），目前轉G10-aroA基因的玉米已于2020年1月獲得安全證書，具有良好的應用前景。來源于熒光假單胞菌G2菌株的G2-aroA基因，能夠賦予轉基因水稻、玉米、大豆、棉花、煙草和油菜等耐受草甘膦的能力（ZHANGetal.,2015;DONGetal.,2017;GUOetal.,2015;DUNetal.,2007;WANGetal.,2014），利用G2-aroA基因培育的轉基因玉米已進入安全證書申報階段。1.1.2.2EPSPS基因突變EPSP合酶第90-120氨基酸區(qū)段為與草甘膦的結合區(qū)，其中第96位的甘氨酸是與草甘膦結合的活性位點，另外，第123-134、140-152和355-367肽段也與草甘膦的結合有關（圖1-2）（PADGETTetal.,1991;KREKELetal.,1999）。因此，這些區(qū)段的單一或多個氨基酸發(fā)生突變，會使得EPSPS與草甘膦的結合活性降低，具有草甘膦抗性。靳傳娣利用重疊延伸法對來源于可變鹽單胞菌（Halomonasvarabilis）的EPSPS基因（H.Var-EPSPS）進行突變，獲得了S99A和G100A雙突變的H.Var-EPSPS基因，將突變基因導入玉米后培育出了耐受草甘膦的轉基因玉米植株（靳傳娣，2016）。Lebrun等利用定點突變技術對玉米的EPSPS基因進行突變，獲得了102位（用異亮氨酸代替蘇氨酸）和106位（用絲氨酸代替脯氨酸)突變的雙突變基因2mepsps（LEBRUNetal.,1997），將基因導入棉花、大豆、玉米后，獲得了耐受草甘膦的轉基因植株，含有2mepsps的轉基因大豆DAS44406-6、轉基因棉花GHB614和轉基因玉米HCEM485等共13個轉化體已批準商業(yè)化應用（LEPPINGetal.,2013;http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/gene/default.asp?GeneID=22&Gene=2mepsps）。圖1-2大腸桿菌EPSPS三維結構圖（KREKELetal.,1999）Fig.1-2Three-dimensionalstructureofE.ColiEPSPS（KREKELetal.,1999）I,II：EPSPS的兩個結構域，G96：EPSPS中第96個甘氨酸，是與草甘膦結合?

解草甘膦的細菌（FORLANIetal.,1999）。早在1977年，Nomura和Hilton就分離到了降解草甘膦的細菌菌株（NOMURA&HILTO,1977），目前已報道的具有草甘膦降解活性的細菌包括假單胞菌、黃桿菌、節(jié)桿菌和肺炎克氏桿菌等（朱玉等，2003）。已知草甘膦的降解途徑有兩種，一種是通過C-N鍵斷裂形成氨甲基膦酸（AminomethylPhosphonicAcid,AMPA）和乙醛酸，另一種途徑是通過C-P鍵斷裂生成肌氨酸（SHINABARGERetal.,1986;TALBOTetal.,1984），這些中間代謝產物物進而代謝成為二氧化碳、磷酸和甘氨酸等，從而為微生物提供碳源、磷源和氮源（圖1-3）。在1992年，Barry等分離克隆到了草甘膦氧化還原酶基因gox，此基因能將草甘膦降解為AMPA（BARRYetal.,1992）。1995年，Penalaza-Vazquez等從能降解草甘膦的類鼻祖假單胞菌（Pseudomonaspseddomallei）中克隆了草甘膦降解基因glpA和glpB，這兩個基因能賦予大腸桿菌降解草甘膦的能力。草甘膦氧化還原酶基因goxv247來源于人人蒼白桿菌菌株LBAA，能夠將草甘膦降解為AMPA和乙醛酸，將此基因導入作物中能賦予轉基因作物耐受草甘膦的能力，目前商業(yè)化應用的耐草甘膦轉基因油菜GT73、轉基因玉米Mon810和轉基因甜菜GTSB77中均含有此基因。圖1-3草甘膦降解途徑（頓寶慶，2007）Fig.1-3Glyphosatedegradationpathway（頓寶慶，2007）1.1.2.4草甘膦N-乙�；緩讲莞熟-乙酰轉移酶（glyphosaten-acetyltransferase,GAT）基因（gat），表達的GAT能夠催化一個轉乙�；姆磻�，將乙酰輔酶A（CoA）上的羧基基團轉移至草甘膦的亞氨基上，生成無毒的N-乙酰草甘膦，從而解除其毒性（圖1-4）。Castle等2004年從地衣芽胞桿菌中篩選出了gat基因，并通過DNAshuffling技術進行突變，獲得了編碼高活性的草甘膦N-乙酰轉移酶gat基因，這些g

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3258790