自轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化應(yīng)用以來,耐除草劑一直是轉(zhuǎn)基因作物的主要性狀,2019年耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物的種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的46%。轉(zhuǎn)基因耐除草劑作物的大面積種植帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益,但草甘膦抗性雜草的出現(xiàn)也引起了人們對其產(chǎn)生的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的廣泛關(guān)注�；虿鸱旨夹g(shù)培育的轉(zhuǎn)基因作物能夠很好的避免目標(biāo)性狀逃逸到環(huán)境中所帶來的影響,是防控基因飄流和防止耐草甘膦雜草產(chǎn)生的有效措施。為了利用基因拆分技術(shù)培育aroA_A1501基因耐草甘膦水稻,本研究通過結(jié)構(gòu)分析法篩選基因的可拆分位點(diǎn),并通過功能互補(bǔ)試驗(yàn)獲得基因的可拆分位點(diǎn),通過原核系統(tǒng)分析比較不同位點(diǎn)拆分后,在intein介導(dǎo)下重新組裝蛋白的草甘膦耐受性及酶動(dòng)力參數(shù),獲得適宜的可拆分位點(diǎn),研究結(jié)果為利用基因拆分技術(shù)培育耐草甘膦的轉(zhuǎn)基因水稻提供技術(shù)支撐,同時(shí)為利用基因拆分技術(shù)防控基因飄流、預(yù)防耐草甘膦雜草產(chǎn)生提供技術(shù)儲備。具體研究結(jié)果如下:1)生物信息學(xué)分析預(yù)測aroA_A1501基因編碼的EPSPS蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測出了13個(gè)可能拆分的位點(diǎn)。利用PCR的方法將aro... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

莽草酸合成途徑和草甘膦作用位點(diǎn)（GOMESetal.,2014）

016），目前轉(zhuǎn)G10-aroA基因的玉米已于2020年1月獲得安全證書，具有良好的應(yīng)用前景。來源于熒光假單胞菌G2菌株的G2-aroA基因，能夠賦予轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、大豆、棉花、煙草和油菜等耐受草甘膦的能力（ZHANGetal.,2015;DONGetal.,2017;GUOetal.,2015;DUNetal.,2007;WANGetal.,2014），利用G2-aroA基因培育的轉(zhuǎn)基因玉米已進(jìn)入安全證書申報(bào)階段。1.1.2.2EPSPS基因突變EPSP合酶第90-120氨基酸區(qū)段為與草甘膦的結(jié)合區(qū)，其中第96位的甘氨酸是與草甘膦結(jié)合的活性位點(diǎn)，另外，第123-134、140-152和355-367肽段也與草甘膦的結(jié)合有關(guān)（圖1-2）（PADGETTetal.,1991;KREKELetal.,1999）。因此，這些區(qū)段的單一或多個(gè)氨基酸發(fā)生突變，會(huì)使得EPSPS與草甘膦的結(jié)合活性降低，具有草甘膦抗性。靳傳娣利用重疊延伸法對來源于可變鹽單胞菌（Halomonasvarabilis）的EPSPS基因（H.Var-EPSPS）進(jìn)行突變，獲得了S99A和G100A雙突變的H.Var-EPSPS基因，將突變基因?qū)胗衩缀笈嘤隽四褪懿莞熟⒌霓D(zhuǎn)基因玉米植株（靳傳娣，2016）。Lebrun等利用定點(diǎn)突變技術(shù)對玉米的EPSPS基因進(jìn)行突變，獲得了102位（用異亮氨酸代替蘇氨酸）和106位（用絲氨酸代替脯氨酸)突變的雙突變基因2mepsps（LEBRUNetal.,1997），將基因?qū)朊藁�、大豆、玉米后，獲得了耐受草甘膦的轉(zhuǎn)基因植株，含有2mepsps的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6、轉(zhuǎn)基因棉花GHB614和轉(zhuǎn)基因玉米HCEM485等共13個(gè)轉(zhuǎn)化體已批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用（LEPPINGetal.,2013;http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/gene/default.asp?GeneID=22&Gene=2mepsps）。圖1-2大腸桿菌EPSPS三維結(jié)構(gòu)圖（KREKELetal.,1999）Fig.1-2Three-dimensionalstructureofE.ColiEPSPS（KREKELetal.,1999）I,II：EPSPS的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，G96：EPSPS中第96個(gè)甘氨酸，是與草甘膦結(jié)合?

解草甘膦的細(xì)菌（FORLANIetal.,1999）。早在1977年，Nomura和Hilton就分離到了降解草甘膦的細(xì)菌菌株（NOMURA&HILTO,1977），目前已報(bào)道的具有草甘膦降解活性的細(xì)菌包括假單胞菌、黃桿菌、節(jié)桿菌和肺炎克氏桿菌等（朱玉等，2003）。已知草甘膦的降解途徑有兩種，一種是通過C-N鍵斷裂形成氨甲基膦酸（AminomethylPhosphonicAcid,AMPA）和乙醛酸，另一種途徑是通過C-P鍵斷裂生成肌氨酸（SHINABARGERetal.,1986;TALBOTetal.,1984），這些中間代謝產(chǎn)物物進(jìn)而代謝成為二氧化碳、磷酸和甘氨酸等，從而為微生物提供碳源、磷源和氮源（圖1-3）。在1992年，Barry等分離克隆到了草甘膦氧化還原酶基因gox，此基因能將草甘膦降解為AMPA（BARRYetal.,1992）。1995年，Penalaza-Vazquez等從能降解草甘膦的類鼻祖假單胞菌（Pseudomonaspseddomallei）中克隆了草甘膦降解基因glpA和glpB，這兩個(gè)基因能賦予大腸桿菌降解草甘膦的能力。草甘膦氧化還原酶基因goxv247來源于人人蒼白桿菌菌株LBAA，能夠?qū)⒉莞熟⒔到鉃锳MPA和乙醛酸，將此基因?qū)胱魑镏心苜x予轉(zhuǎn)基因作物耐受草甘膦的能力，目前商業(yè)化應(yīng)用的耐草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜GT73、轉(zhuǎn)基因玉米Mon810和轉(zhuǎn)基因甜菜GTSB77中均含有此基因。圖1-3草甘膦降解途徑（頓寶慶，2007）Fig.1-3Glyphosatedegradationpathway（頓寶慶，2007）1.1.2.4草甘膦N-乙�；緩讲莞熟-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glyphosaten-acetyltransferase,GAT）基因（gat），表達(dá)的GAT能夠催化一個(gè)轉(zhuǎn)乙�；姆磻�(yīng)，將乙酰輔酶A（CoA）上的羧基基團(tuán)轉(zhuǎn)移至草甘膦的亞氨基上，生成無毒的N-乙酰草甘膦，從而解除其毒性（圖1-4）。Castle等2004年從地衣芽胞桿菌中篩選出了gat基因，并通過DNAshuffling技術(shù)進(jìn)行突變，獲得了編碼高活性的草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因，這些g

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3258790