目的建立利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小鼠MAD2L1基因第二外顯子基因編輯的方法體系,并分析CRISPR/Cas9對(duì)MAD2L1基因編輯的脫靶效應(yīng)。方法通過CHOPCHOP網(wǎng)站設(shè)計(jì)位于小鼠MAD2L1基因第二外顯子的靶點(diǎn)序列,并構(gòu)建Cas9-MAD2L1載體,將該載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細(xì)胞中,通過嘌呤霉素篩選并結(jié)合熒光顯微鏡觀察GFP后,提取細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的基因組DNA,利用PCR方法,結(jié)合T7E1分析和桑格爾測(cè)序,鑒定對(duì)小鼠MAD2L1基因編輯情況,并對(duì)轉(zhuǎn)染后的NIH/3T3細(xì)胞進(jìn)行CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)分析。結(jié)果將Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細(xì)胞并進(jìn)行嘌呤霉素篩選后,熒光顯微鏡下觀察到大量表達(dá)GFP的細(xì)胞,PCR結(jié)合T7E1結(jié)果顯示,以轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞DNA為模板擴(kuò)增出的228 bp MAD2L1 PCR產(chǎn)物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,測(cè)序結(jié)果顯示,成功對(duì)MAD2L1基因第二外顯子靶點(diǎn)處進(jìn)行基因編輯,脫靶效應(yīng)分析未檢測(cè)到CRISPR/Cas9有對(duì)脫靶位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。結(jié)論成功建立對(duì)小鼠MAD2L1基因第二外顯子進(jìn)行基因編輯的方法體系,設(shè)計(jì)的對(duì)M... 

【文章來源】：中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào). 2017,25(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 小鼠MAD2L1基因序列分析和基因敲除靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)
        1.2.2 用于敲除小鼠MAD2L1的CRISPR/Cas9載體 (Cas9-MAD2L1) 構(gòu)建
            (1) Oligo二聚體的形成
            (2) Oligo二聚體插入到Cas9/gRNA載體中
        1.2.3 Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染小鼠NIH/3T3細(xì)胞和嘌呤霉素篩選
        1.2.4 小鼠MAD2L1基因修飾分析
        1.2.5 Cas9-MAD2L1脫靶效應(yīng)分析
2 結(jié)果
    2.1 小鼠MAD2L1基因修飾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果
    2.2 用于敲除小鼠MAD2L1的CRISPR/Cas9載體 (Cas9-MAD2L1) 構(gòu)建結(jié)果
    2.3 熒光顯微鏡觀察嘌呤霉素篩選Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染后的NIH/3T3細(xì)胞
    2.4 MAD2L1基因敲除結(jié)果分析
    2.5 脫靶效應(yīng)分析
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