百合（Lilium）作為國際四大切花之一,在全球花卉產(chǎn)業(yè)中具有重要地位。種球生產(chǎn)是百合產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)�，F(xiàn)有研究表明鱗莖發(fā)育與淀粉積累密切相關(guān),蔗糖作為百合鱗莖內(nèi)糖分轉(zhuǎn)運的主要形式,在蔗糖合成酶（Sucrose Synthase,SuSy,EC 2.4.1.13）調(diào)控下參與淀粉合成,對鱗莖形態(tài)建成具有重要意義。目前國內(nèi)外對百合植株生長發(fā)育過程中鱗莖物質(zhì)代謝的研究僅限于生理層面,分子研究尚少。為探究SuSy對百合鱗莖蔗糖-淀粉代謝的調(diào)控機理,本試驗在前期成功克隆LdSuSy基因的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)探究了LdSuSy基因的分子生理功能。首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),成功對百合LdSuSy基因進行了定向編輯,獲得敲除突變體;同時構(gòu)建LdSuSy過表達載體并利用農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因株系;以敲除突變體和LdSuSy轉(zhuǎn)基因株系為材料,結(jié)合qRT-PCR技術(shù)和生理測定研究了LdSuSy對百合植株及鱗莖發(fā)育的影響。主要試驗結(jié)果如下:1.利用雙酶切法構(gòu)建了融合表達載體LdSuSy1-GFP和LdSuSy3-GFP,采用農(nóng)桿菌介導法在煙草葉片中瞬時表達,通過激光共聚焦顯微鏡觀察,證實LdSuSy1... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

庫組織細胞中糖--淀粉代謝（SteinOandGranotD.,2019）

沈陽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文17浴30min后立即42°C熱激90s，立即再次冰浴3min，加入500μLLB液體培養(yǎng)基后震蕩培養(yǎng)1h（37°C，200rpm）。在待涂菌液中加入16μLX-gal（20mg·mL-1），8μLIPTG（50mg·mL-1），將藥品顛倒混勻。吸取200μL菌液均勻涂在含有100mg·L-1Amp的LB抗性平板上，將平板倒置在37°C恒溫箱培養(yǎng)24h，待平板長出單克隆菌落，挑取白色單菌落進行菌落PCR鑒定。同時將菌挑取在含有100mg·L-1Amp的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)震蕩培養(yǎng)（37°C，200rpm）。選取菌液PCR結(jié)果與預期片段大小相同的菌液送往生工生物工程有限公司進行測序驗證。選擇驗證正確的菌液進行擴搖，提取質(zhì)粒后于-20°C保存。（2）雙酶切載體和目的片段圖2-1植物表達載體pRI101多克隆位點Fig.2-1CloningsiteofexpressionvectorpRI101利用NdeI和BamHI對表達載體pRI101-GFP及PCR產(chǎn)物LdSuSy-Y進行雙酶切，反應體系如表2-9。表2-9酶切pRI101及LdSuSy-Y反應體系Table2-9EnzymecutpRI101andLdSuSy-Yreactionsystem試劑Reagents體積（μL）Volume（μL）10×TBufferII3.0NdeI1.0BamhI1.0pRI101及LdSuSy-Y5.037°C酶切3h，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物后，采用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。再次用1.5%瓊脂糖凝膠電泳膠檢測回收產(chǎn)物，驗證與預期片段大小相符后，用于后續(xù)試驗。（4）載體與目的片段的連接

圖2-2雙靶點PCR擴增片段結(jié)構(gòu)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]玉米蔗糖合成酶基因家族的全基因組鑒定及表達分析[J]. 陳曙,趙秋芳,陳宏良,金輝.  西南農(nóng)業(yè)學報. 2019(11)
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碩士論文
[1]蘭州百合蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因的克隆及原核表達[D]. 程金云.沈陽農(nóng)業(yè)大學 2017
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[3]波蘭小麥蔗糖合成酶基因的克隆及表達分析[D]. 鄭翰.四川農(nóng)業(yè)大學 2014
[4]甜瓜果實蔗糖合成酶基因（SS）的克隆、表達分析及遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 聞小霞.山東農(nóng)業(yè)大學 2010
[5]甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆及其結(jié)構(gòu)分析[D]. 雷美華.福建師范大學 2008
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本文編號：3250957