為通過慢病毒感染細胞構建穩(wěn)定表達CRISPR/Cas9的293T細胞系,實現(xiàn)高效率基因編輯, PCR擴增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒載體pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,將該質粒與慢病毒包裝質粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT細胞, 48 h后收集病毒并濃縮純化測定其病毒滴度,最后用純化后的病毒感染293T細胞,通過抗性和熒光標記篩選得到穩(wěn)定表達Cas9的細胞系,并對單克隆細胞進行DNA、RNA特異性和反轉錄驗證。針對ABCG4基因設計sgRNA并構建重組載體感染單克隆細胞,通過DNA特異性和T7E1酶切驗證基因敲除效率。結果表明:成功構建了Cas9-pLent慢病毒載體,用構建成功的慢病毒載體對293FT細胞進行慢病毒包裝（三質粒系統(tǒng)）并對包裝成功的病毒進行了濃縮與純化,最后通過病毒感染293T細胞,采用熒光觀察的方式測定其病毒滴度均在10⁶ TU·mL^-1之上。用純化后的病毒感染293T細胞并通過加藥（Puro）進行抗性篩選,篩選出3株能穩(wěn)定表達Cas9的293T細胞系,目的基因ABCG4的... 

【文章來源】：揚州大學學報(農業(yè)與生命科學版). 2020,41(04)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

Cas9-293T單細胞篩選

Cas9-293T提取RNA驗證

Cas9片段擴增產(chǎn)物

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3249690