為通過慢病毒感染細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CRISPR/Cas9的293T細(xì)胞系,實(shí)現(xiàn)高效率基因編輯, PCR擴(kuò)增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒載體pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,將該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT細(xì)胞, 48 h后收集病毒并濃縮純化測(cè)定其病毒滴度,最后用純化后的病毒感染293T細(xì)胞,通過抗性和熒光標(biāo)記篩選得到穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞系,并對(duì)單克隆細(xì)胞進(jìn)行DNA、RNA特異性和反轉(zhuǎn)錄驗(yàn)證。針對(duì)ABCG4基因設(shè)計(jì)sgRNA并構(gòu)建重組載體感染單克隆細(xì)胞,通過DNA特異性和T7E1酶切驗(yàn)證基因敲除效率。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了Cas9-pLent慢病毒載體,用構(gòu)建成功的慢病毒載體對(duì)293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝（三質(zhì)粒系統(tǒng)）并對(duì)包裝成功的病毒進(jìn)行了濃縮與純化,最后通過病毒感染293T細(xì)胞,采用熒光觀察的方式測(cè)定其病毒滴度均在10⁶ TU·mL^-1之上。用純化后的病毒感染293T細(xì)胞并通過加藥（Puro）進(jìn)行抗性篩選,篩選出3株能穩(wěn)定表達(dá)Cas9的293T細(xì)胞系,目的基因ABCG4的... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2020,41(04)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

Cas9-293T單細(xì)胞篩選

Cas9-293T提取RNA驗(yàn)證

Cas9片段擴(kuò)增產(chǎn)物

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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