發(fā)布時(shí)間：2021-06-25 15:47

　　肝素是一種抗凝藥物,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域,但是目前市場(chǎng)上的肝素藥物大多數(shù)都是由動(dòng)物組織提取得到,有潛在的不安全因素和供應(yīng)隱患。為了解決這一問(wèn)題,非動(dòng)物源肝素的制備成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)。而heparosan的多糖骨架和肝素類(lèi)似,只是未將葡萄糖醛酸異構(gòu)化為艾杜糖醛酸,也沒(méi)有進(jìn)行硫酸化修飾,可對(duì)其進(jìn)行酶化學(xué)修飾制備肝素類(lèi)藥物。經(jīng)過(guò)對(duì)heparosan合成路徑的分析,本文選擇谷氨酰胺含量豐富的食品級(jí)微生物谷氨酸棒狀桿菌作為宿主,構(gòu)建了產(chǎn)heparosan的重組菌株,為后續(xù)的肝素類(lèi)藥物的制備奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本論文的主要研究結(jié)果如下:（1）通過(guò)將外源基因KfiA和KfiC導(dǎo)入到谷氨酸棒狀桿菌中,構(gòu)建了產(chǎn)heparosan的重組菌株AC,并且合成的heparosan是胞內(nèi)產(chǎn)品,發(fā)酵36 h時(shí)胞內(nèi)heparosan產(chǎn)量最高達(dá)331.2 mg/L。（2）以AC菌株為基礎(chǔ),通過(guò)過(guò)表達(dá)hasB和galU基因、外源添加KfiB和KfiD基因,構(gòu)建了一株搖瓶產(chǎn)量1 g/L左右的重組菌株galU。還在BDH菌株的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了糖酵解途徑的弱化,最好的弱化菌株A3相比于BDH菌株產(chǎn)量提高了 17.53%。（3）確定了... 

【文章來(lái)源】：北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：117 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１肝素的五塘序列與抗凝血酶結(jié)合的示意圖［３］??

ｆａｔｉｏｎ??ＧｋｊｃｕｍｎｙｌＣＳ－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ?｜?ｃ５－ｅｐ？ｎｅ，ｉｚａｔｉｏｎ??Ｏｌｊ－？？，魯？號(hào)??２－，３－，６－Ｏ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ?＾?２－?３－，?Ｂ－Ｏ－ｓｕＨａｔｉｏｎｓ??Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ?ｔｅｎｄｉｎｇ?ｐｅｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ??Ｂ｜ＧｌｃＮＡｃ?（￣）ＧｌｃＡ?ｆ＾ｌｄｏＡ?＜｜＞?Ｓｕｌｆａｔｅ?ｇｒｏｕｐ?－？魯，、一Ｓｅｒ?Ｔｈｅ?ｌｉｎｋａｇｅ?ｒｅｇｉｏｎ?ｉｎ?ｈｅｐａｒｉｎ?ｂｂｓｙｎｔｈｅｓｒｓ??圖１－２肝素的生物合成過(guò)程Ｗ??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｈｅｐａｒｉｎ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐｒｏｃｅｓｓ??１．１．２肝素藥物制備方法??到目前為止，肝素己經(jīng)有一百多年的歷史，市場(chǎng)上銷(xiāo)售的肝素藥物大多數(shù)都是由??動(dòng)物提取法得到，這種方法具有潛在的不安全因素和供應(yīng)隱患，而且對(duì)受用人群有所??限制。十幾年前人們也化學(xué)合成了肝素類(lèi)藥物，這種方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、且合成效率低，??也不能替代天然肝素的全部功效。因此近年來(lái)的研究熱點(diǎn)集中于酶法或者酶化學(xué)法制??備肝素的新方法研宄，通過(guò)一系列的酶化學(xué)修飾等手段對(duì)ｈｅｐａｒｏｓａｎ進(jìn)行修飾來(lái)制備??肝素藥物。??（１）物理提取法??物理法是采用物理分離的手段從豬小腸或者牛肺等含有肝素的原料組織中將肝??素提取出來(lái)，首先從原料組織中提取得到粗肝素，經(jīng)過(guò)純化之后可以得到純肝素［７］。??這種方法制備出來(lái)的肝素樣品是分子量在１４?ｋＤａ的肝素，將其使用化學(xué)降解或者酶??２??

?北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文???Ｖ——取心??—????Ｊ?ｏｃ＾ｊｍｈ＾?＜ＪＯＨ〇?＾??錢(qián)＾巴?二卜＇餐：多??＿＿一?．。Ｅ?＝?二訪？??ｌ＾＾ＬｓＪ?ｓｒｓｒ１?＾?＾??圖１－３超低分子肝素的酶化學(xué)法合成示意圖［１９］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｅｎｚｙｍａｔｉｃ?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｈｅｐａｒｉｎ??徐永梅等人在２０１２年又報(bào)道體外酶化學(xué)合成硫酸乙酰肝素的途徑［２Ｇ］，如圖圖１－４??所示。大致的合成機(jī)制和上述超低分子肝素的合成類(lèi)似，都是包括骨架合成和修飾兩??個(gè)合成階段。在欠片４和；的作用下將糖基供體上的糖基單元依次連接到二糖單??元上進(jìn)行骨架的合成，然后在堿性條件下進(jìn)行去乙�；停危蛩峄揎�，之后又進(jìn)行??了異構(gòu)化和〇－硫酸化修飾可最終制備硫酸乙酰肝素。??ｓｔａｒｔｎｏｄｗｃｃｈａｎｄｅ?＾?Ｊ?ＡＴ＾ｎｄｉｎａ?￥ｔｔ？?ｂ？ｃＷ？ｏ？?ＡＴ＾ｊ〇＜Ｓｎｇ?ｉ８＊?ｗｄ?ｌｉｒｆｃｗ?ｂＫｋｂｏｆｔ＊??ｆｌｓｐｅａｔ?ｈｗｏ?ｔｉｍｅｓ??ｌ?ｔＦＡ?ｊ?ｔＦＡ?Ｒ?１，?ａｔｏｔｍｅ?ｄ＊＿ｕ〇ｆ〇ｗ＊ｔｖＷｉｏｎ??Ｎ??Ｍ－ＴＦＡ?ｐ＾ｉａｄｅｃｆｔｓａｏｃｈｔｆｉｄｔ?（１＆ｍ？ｒ，?ｎ？２）?２?ｉｖ＾ｉｉｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａ＊?ＰＡＰＳ?？？ｉｉｆｏ?ｐ＊ｎｔ？ｄ？ａｉＳＫｄ？ｒｉｉ］？．?１?ｌ１Ｓｎ？ｒ?ｎ?＊２）??ｒ＾ｘｔａｔ?ｎ?ｅｍ?（ｎ?？?２．３，４，?？ｍｄ?Ｓ）?＾ＴＦ＊?Ｎｓｐ＆ｔｔｅｃａｓａｃｃｈａｒ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]Heparosan的提取分離及其對(duì)腸道菌作用的研究[D]. 陳祥娥.山東大學(xué) 2012
[2]肝素提取純化新工藝及降解后的生物活性研究[D]. 張麗萍.吉林大學(xué) 2010

碩士論文
[1]肝素酶Ⅰ、Ⅲ的表達(dá)和應(yīng)用及E.coli K5 waaR基因的敲除[D]. 呂沈聰.浙江工業(yè)大學(xué) 2013
[2]肝素前體多糖的分離純化研究[D]. 楊明康.浙江工業(yè)大學(xué) 2013
[3]K5多糖大腸桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化及其K5裂解酶研究[D]. 高金卉.江南大學(xué) 2012
[4]E.coli K5高密度發(fā)酵生產(chǎn)heparosan及其分離純化[D]. 黎鴻平.浙江工業(yè)大學(xué) 2012
[5]肝素精制及低分子量肝素的制備[D]. 張萬(wàn)忠.北京化工大學(xué) 2001



本文編號(hào)：3249482