作為一種天然的抑菌物質,溶菌酶對抗生素耐藥菌有較強的殺傷作用,具有無耐藥性、無殘留等特點,被認為在諸如動物飼料、藥品等領域可有效代替抗生素,改善濫用抗生素所引起的一系列問題,市場前景巨大。通過微生物發(fā)酵大規(guī)模生產重組溶菌酶符合市場發(fā)展趨勢,由于目前生產的菌株表達量偏低,限制了溶菌酶的應用和產業(yè)化發(fā)展。為提高蛋清溶菌酶的發(fā)酵表達量,根據畢赤酵母密碼子的偏愛性,對其編碼基因進行密碼子優(yōu)化,并構建了真核分泌表達載體pPIC9K-coEWL,經遺傳霉素G418抗性篩選后,獲得了一株酵母轉化子（G-pcoEWL）,其對G418的抗性濃度高達15 mg·mL-1。在28℃、pH 6.0、轉速240 r·min-1和甲醇濃度1%的誘導條件下,酵母重組子G-p-coEWL經搖瓶培養(yǎng)72 h,實現(xiàn)了蛋清溶菌酶的分泌表達。在發(fā)酵上清液中,總蛋白濃度為607 mg·L-1,酶活達到677 U·mL-1。此外,本實驗還比較了葡聚糖凝膠柱Sephadex G-50和強酸性陽離子交換柱SP-Sepharose FF兩種方法對目的蛋白的分離效果,得到Sephadex G-50的分離效果更好,并在14.4 kDa處得... 

【文章來源】：浙江大學學報(理學版). 2020,47(04)北大核心CSCD

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【圖文】：

重組表達載體pPIC9K-coEWL的構建

通過設計與畢赤酵母表達載體pPIC9K具有同源區(qū)段的引物，以優(yōu)化后的合成基因片段為模板，通過高保真PCR擴增出帶同源臂的coEWL基因的ORF區(qū)段，獲得422 bp目的基因片段，其瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示。采用無縫克隆技術連接至酶切后pPIC9K線性空載體，構建真核表達載體pPIC9K-coEWL。將重組質粒轉至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后，篩選出陽性轉化子并抽提質粒，經BamHI、Sal I雙酶切后，得到2 614 bp和7 037 bp目的基因片段，結果如圖4所示。測序結果顯示重組質粒pPIC9K-coEWL構建正確。圖3 coEWL PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

coEWL PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

【參考文獻】：
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3238160