CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有識別并切割特定序列DNA的功能,是廣泛應(yīng)用的基因編輯工具。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以高效地產(chǎn)生基因敲除,但是精確的基因編輯的效率仍然很低,這主要是由于同源重組修復(fù)的效率很低。目前已有多個方法可以在一定程度上提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組的效率,例如抑制非同源末端連接修復(fù),優(yōu)化同源模板的設(shè)計等。最近有研究報道將Cas9 RNP和同源模板相繼電轉(zhuǎn)染進細(xì)胞提高了同源重組的效率,但是其具體機制仍不清楚。因此,本研究探討了共轉(zhuǎn)染CRISPR質(zhì)粒和同源重組模板對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率的影響以及可行的降低影響的辦法。首先,我們用T7E1內(nèi)切酶實驗和RT-qPCR檢測了只轉(zhuǎn)染CRISPR質(zhì)粒組以及共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和模板組細(xì)胞內(nèi)Cas9的切割效率,RNA和DNA水平的差異。其次,檢測了降低共轉(zhuǎn)染的同源模板DNA的數(shù)量時,細(xì)胞內(nèi)Cas9DNA和RNA水平的變化。然后,將GFP質(zhì)粒分別和單鏈DNA、雙鏈DNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強度。最后,為了驗證將二者相繼轉(zhuǎn)染是否可以降低上述的影響,我們先轉(zhuǎn)染了 CRISPR質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染了同源重組模... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２?ＣＲＩＳＰＲ質(zhì)粒和同源重組修復(fù)模板共轉(zhuǎn)染降低了細(xì)胞內(nèi)Ｃａｓ９的表達水平和ＤＮＡ含量??Ａ．實時定量ＰＣＲ檢測細(xì)胞內(nèi)Ｃａｓ９的表達水平

??染ＣＲＩＳＰＲ質(zhì)粒組的差距顯著縮�。▓D３Ｂ）。這些都與細(xì)胞內(nèi)Ｃａｓ９的ＤＮＡ水平的??變化基本一致。雖然共轉(zhuǎn)染ｄｓＤＮＡ模板的細(xì)胞內(nèi)Ｃａｓ９的ＲＮＡ水平也在模板數(shù)量??為１?ｐｍｏｌ時顯著提高，但是仍與只轉(zhuǎn)染ＣＲＩＳＰＲ質(zhì)粒組的細(xì)胞內(nèi)的Ｃａｓ９表達水平??有明顯差距（圖３Ｂ）。??Ａ??１０ｈ?２４ｈ??＊＊??＜?１５１?二?＊＊＊＊?１?＊＊＊＊?＜?１５－，??Ｚ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?１??Ｑ?Ｔ?ｑ??ｗ?支?打?－１??０?１０－ｉ?Ｔ?ｆ?■＊＊＊＊?Ｉ?、一?，?ｒ?，??２；?〇．〇ｉＵ?１?臟??Ｓ?〇．〇］！■?■?＿???Ｔ２：?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋＋?Ｔ２：?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋??Ｄｏｎｏｒ：?＿?１０?５?１?１０?５?１?１０?５?１?ｐｍｏｌ?Ｄｏｎｏｒ：?一?ｉ〇?５?１?１０?５?１?１０?５?１?ｐｍｏｌ??ｓｔ?ｓｎ?ｄｓ?ｓｔ?ｓｎ?ｄｓ??Ｂ??２４ｈ?４８ｈ??＜?１－５ｉ?＜?１－５ｉ?

??并在Ｔ２質(zhì)粒切割位點附近設(shè)計了四條相同長度的ｓｓＤＮＡ?（圖４Ａ），通過退火形成??了?２４ｂｐ，１６ｂｐ和８ｂｐ三種不同互補長度的ｄｓＤＮＡ。??通過將ＰＥＧＦＰ－Ｎ２質(zhì)粒與ｓｓＤＮＡ或三種不同互補長度的ｄｓＤＮＡ共轉(zhuǎn)染，我們??發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和ｄｓＤＮＡ的細(xì)胞內(nèi)ＧＦＰ的熒光強度均低于共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和ｓｓＤＮＡ??的細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)染了完全互補的ｄｓＤＮＡ的細(xì)胞內(nèi)ＧＦＰ熒光強度最弱，而隨著ｄｓＤＮＡ??的互補長度的縮短，即單鏈區(qū)域長度的增加，細(xì)胞內(nèi)ＧＦＰ熒光強度逐漸增強（圖??４Ｂ）。??Ａ???ｓｓＤＮＡ?（ｓ）??５’?－?ＡＧＧＣＣＴＡＡＧＧＡＴ６ｅ６ＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡｆＤＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡｅＴＧｅＣＣＣＣ／？）ｃＴ６ＴＧＧＧＧＴＧｅＡ６Ｇ６?－３ｒ??．（＞?＞?■．?．?＜－■?Ｉ?＜?＾?＞?＞?－ｈＴＴ?？?Ｉ?？？?．?．?ｉ?．?．?■?Ｉ?Ｉ?■?■?■?ｕ?■?Ｔ７ＴＩ?．?Ｉ?■?．?）?．?■?Ｉ?■?Ｉ?■?＞?■?＞??３，?－?ＴＣＣＧＧＡＴＴＣＣＴ＾ＣＣＣＣＧＡＡｌＡＡＧＡＣＡＧｆＧＧＴＴＡＧＧ／＾ＣＡＧＧＧＡＴＣｊＡＣＣＧＧＧＧＴｌＧＡＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣ?＿?５＊??ｓｓＤＮＡ?（ａ２）?ｓｓＤＮＡ?（ａ”?ｓｓＤＮＡ?（ａ）??Ｂ??ｓｓＤＮＡ（ｓ）?ｓｓＤＮＡ（ａ）?ｓｓＤＮＡ（ａｌ）?ｓｓＤＮＡ（ａ２）??＿＿＿＿??ｄｓＤＮＡ（ｓ＋ａ）?ｄｓＤＮＡ（ｓ＋ａ１）?ｄｓＤＮＡ（ｓ＋ａ２）??ｈＢＩＨＥＢＢＳｈ??圖４?ＤＮＡ的雙鏈互補片段降低了共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率??Ａ．?位點內(nèi)不同互補長度的ｓｓＤＮＡ設(shè)計圖。ｓｓＤＮＡ（ｓ）

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本文編號：3228388