利用PCR產(chǎn)物單克隆測(cè)序的方法,對(duì)3個(gè)垂穗披堿草材料的葉綠體基因組非編碼區(qū)序列trnL-F和線粒體基因nad4片段進(jìn)行了變異分析。結(jié)果表明:在同一個(gè)個(gè)體中可以檢出1個(gè)以上的trnL-F和nad4變異型,不同變異型在不同材料中占比不同;在3個(gè)垂穗披堿草材料的38個(gè)克隆序列中共檢測(cè)到7種trnL-F變異型,7種變異型中共檢測(cè)到13個(gè)突變位點(diǎn),共有14個(gè)突變,變異型突變以堿基轉(zhuǎn)換為主（92.3%）,變異型1為3個(gè)材料的共享類型,在3個(gè)材料所測(cè)克隆中占比分別為53.3%、100%和61.1%;在3個(gè)材料的62個(gè)克隆序列中共檢測(cè)到17種nad4變異型,17種變異型中檢測(cè)到變異位點(diǎn)55個(gè),變異型突變以堿基轉(zhuǎn)換（58.2%）和堿基顛換為主（34.5%）,變異型2為3個(gè)材料的共享類型,在3個(gè)材料所測(cè)克隆中占比分別為68.4%、15.0%和13.0%,另外有11個(gè)變異型為2個(gè)材料所共享類型。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)草地學(xué)報(bào). 2020,42(06)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

葉綠體與線粒體基因組PCR擴(kuò)增片段測(cè)序波峰圖

因推測(cè)細(xì)胞質(zhì)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)條帶中可能包含有不止1條序列,因此對(duì)來(lái)自同一個(gè)個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌培養(yǎng),挑取單克隆進(jìn)行常規(guī)測(cè)序, 結(jié)果測(cè)序峰圖規(guī)則,波峰和波谷清晰,無(wú)套峰存在(圖3)。對(duì)材料nw6-5的trnL-F和nad4基因片段各10個(gè)以上克隆測(cè)序結(jié)果的初步分析表明,不同克隆間目標(biāo)序列同源性并不為100%,存在SNP變異序列。由于在獲取目標(biāo)序列的過(guò)程中要經(jīng)過(guò)基因組PCR擴(kuò)增、目標(biāo)序列克隆等分子生物學(xué)操作過(guò)程,有必要進(jìn)一步排除PCR擴(kuò)增偏差或序列克隆過(guò)程中有可能產(chǎn)生的人為誤差。2.3 PCR產(chǎn)物單克隆測(cè)序誤差結(jié)果排除

以垂穗披堿草總基因組DNA為模板,對(duì)3個(gè)垂穗披堿草個(gè)體分別用trnL-F和nad4引物(表1)進(jìn)行葉綠體tRNA基因trnF-L區(qū)段以及線粒體乙酰脫氫酶基因nad4區(qū)段的擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),條帶清晰單一(圖1)。所擴(kuò)增的葉綠體片段長(zhǎng)度為600bp左右,線粒體片段長(zhǎng)度為500bp左右,符合預(yù)期目標(biāo)片段大小(表1)。對(duì)經(jīng)瓊脂糖檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,將所測(cè)序列進(jìn)行序列人工校對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)測(cè)序峰圖規(guī)則,波峰和波谷清晰,但是部分個(gè)體序列中有明顯的套峰存在(圖2)。排除是測(cè)序起始或結(jié)束時(shí)所產(chǎn)生的測(cè)序錯(cuò)誤,認(rèn)為某些序列中的套峰為真實(shí)存在。由于PCR產(chǎn)物是在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè),類凝膠很難對(duì)幾個(gè)bp的差異進(jìn)行區(qū)分,更不能區(qū)分單核苷酸(SNP)差異,因此推測(cè)利用基因組DNA進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)基因擴(kuò)增的產(chǎn)物可能并不為單一的序列。將PCR產(chǎn)物所測(cè)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì),結(jié)果所測(cè)trnL-F和nad4序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中trnL-F和nad4的序列相似性在96%～100%之間,表明所獲目標(biāo)序列正確。圖2 葉綠體與線粒體基因組PCR擴(kuò)增片段測(cè)序波峰圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3226481