發(fā)布時間：2021-06-08 13:27

　　目的:甲狀腺激素（Thyroid hormones,THs）在腦發(fā)育過程中發(fā)揮重要影響。其主要是通過與甲狀腺激素核受體（Thyroid hormone receptors,THRs）結(jié)合,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮其生物學(xué)功能。本研究根據(jù)首例報(bào)道的THRA基因突變患者的突變位點(diǎn)（THRA-E403X）,構(gòu)建了Thrαl^E403x小鼠模型,對突變小鼠進(jìn)行全身各系統(tǒng)表型分析,并重點(diǎn)探討Thrαl^E403x突變對小鼠大腦皮層形態(tài)和功能影響的機(jī)制研究。方法:根據(jù)同源重組原理,利用同源DNA片段替換靶基因片段技術(shù),對THRA基因第403位點(diǎn)的堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變（G-T）,進(jìn)而改變對應(yīng)的氨基酸序列（403E突變?yōu)?03X）,制備出特異位點(diǎn)突變的Thrαl^E403x小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠周齡分別為出生后3周齡、6周齡、16周齡,分別相當(dāng)于人類幼兒期、青春期、成年期。研究內(nèi)容:（一）、小鼠全身表型分析:包括:1.對同窩的各組小鼠進(jìn)行為期42周生長發(fā)育（體重、身長、尾長）監(jiān)測;2.利用放射免疫測定方法檢測小鼠甲狀腺激素水平;3.利用Micro-CT檢測... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

Thrα1E403X小鼠表型分析相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文8123456789023456789圖2.2本研究中小鼠足趾編號標(biāo)記方法2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1小鼠基因型鑒定方法（1）主要試劑配制1.配制小鼠鼠尾消化液（SSTE）：儲備液：1.配2.5MNaCl儲備液：7.305gNaCl+50mlddH2O2.配1MTris(PH=8.0)儲備液：60.55gTris+40mlddH2O，定容至50ml，調(diào)溶液PH值為8.03.配10%SDS儲備液：5gSDS+50mlddH2O4.配0.5MEDTA.2Na儲備液：9.305gEDTA.2NA+40mlddH2O，定容至50ml，調(diào)溶液PH值為8.0工作液：將儲備液稀釋為工作液1.取100mM/NaCl：2ml2.取150mM/Tris：7.5ml3.取1%/SDS：5ml4.取100mM/EDTA.2Na:10ml5.取ddH2O：25.5ml6.總量50ml，即為SSTE工作液2.配制DNA凝膠電泳緩沖液（TBE緩沖液）

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文153結(jié)果3.1Thrα1E403X模型小鼠的建立運(yùn)用同源重組原理，利用同源DNA片段替換靶基因片段技術(shù)，對THRA基因第9外顯子第1207位堿基定點(diǎn)改變，由G變?yōu)門，引起對應(yīng)第403位氨基酸由谷氨酸改變?yōu)榻K止密碼子（403E突變?yōu)?03X），制備出特異位點(diǎn)突變的Thra1E403X基因小鼠（如圖3.1）。圖3.1同源重組原理建立Thrα1E403X等位基因以及Thrα1E403X小鼠的建立注.圖A．產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的靶向載體的示意圖，其中l(wèi)oxp在PGK/EM7-Neo的第8-9內(nèi)含子和第9外顯子上的Thra1E403(c1207G)突變?yōu)門hra1X403(c1207T)。隨后使用cre轉(zhuǎn)基因?qū)eo盒取出。圖B．利用DNA測序技術(shù)證實(shí)該突變。利用兩種引物序列，獲得450bp片段DNA：


本文編號：3218551