紡錘鏈霉菌（Streptomyces netropsis）eriSD-07是本實(shí)驗(yàn)室2007年發(fā)現(xiàn)的一株放線(xiàn)菌,它所產(chǎn)的多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素是以五烯和七烯為主的混合物,五烯含量最高,并且五烯類(lèi)的抗生素已經(jīng)解析出化學(xué)結(jié)構(gòu),命名為濟(jì)南霉素（Jinanmycin）,相比兩性霉素B及制霉菌素,SD-07所產(chǎn)抗生素有更強(qiáng)的抗真菌活性,具有開(kāi)發(fā)為新型抗真菌抗生素的潛力,因此有必要對(duì)濟(jì)南霉素在SD-07中的生物合成路徑以及其合成相關(guān)PKS基因簇的基因敲除工作進(jìn)行一系列研究與探索。本文工作如下:1.紡錘鏈霉菌SD-07全基因組掃描測(cè)序完成,并對(duì)濟(jì)南霉素在SD-07中的生物合成進(jìn)行了詳細(xì)生物信息學(xué)分析SD-07基因組堿基總數(shù)為7593656bp,經(jīng)antismash預(yù)測(cè)分析,共得到46個(gè)基因簇,其中cluster32最有可能為紡錘鏈霉菌SD-07多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的編碼基因簇,定位于4266507-4419580 bp,總大小153074bp,其中PKS相關(guān)基因定位于4286507-4388174bp,總大小101667bp,推測(cè)為合成濟(jì)南霉素的基因簇。接下來(lái)對(duì)濟(jì)南霉素在SD-07中的生物合成路徑進(jìn)行... 

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【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 鏈霉菌及多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素簡(jiǎn)介
    1.2 濟(jì)南霉素簡(jiǎn)介
    1.3 鏈霉菌基因敲除方法簡(jiǎn)介
    1.4 Red/ET重組工程簡(jiǎn)介
        1.4.1 Red/ET重組的原理
        1.4.2 Red/ET重組工程的操作步驟
        1.4.3 Red/ET重組工程的應(yīng)用
第二章 多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素濟(jì)南霉素在紡錘鏈霉菌SD-07中的生物合成
    2.1 濟(jì)南霉素簡(jiǎn)介
    2.2 濟(jì)南霉素生物合成
        2.2.1 紡錘鏈霉菌SD-07全基因組掃描測(cè)序
        2.2.2 PKS基因
        2.2.3 PKS后修飾和運(yùn)輸
        2.2.4 細(xì)胞色素P450酶
        2.2.5 糖基化
        2.2.6 輸出
        2.2.7 其他基因
    2.3 本章總結(jié)
第三章 紡錘鏈霉菌SD-07敲除載體的構(gòu)建及基因敲除初探
    3.1 研究背景
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌株及質(zhì)粒
        3.2.2 PCR引物
        3.2.3 培養(yǎng)基及化學(xué)試劑
        3.2.4 抗生素及使用濃度
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 大腸桿菌和鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移
        3.3.2 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        3.3.3 電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟
        3.3.4 敲除載體的構(gòu)建
            3.3.4.1 PCR擴(kuò)增
            3.3.4.2 PCR片段與載體的酶切連接
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 敲除載體pJTU1278-△2166以及pJTU12 78-△5883的構(gòu)建
        3.4.2 確定抗生素工作濃度
        3.4.3 接合轉(zhuǎn)移條件摸索
        3.4.4 電轉(zhuǎn)化條件摸索
        3.4.5 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法條件摸索
    3.5 本章總結(jié)
第四章 紡錘鏈霉菌SD-07中PKS基因簇克隆的探索
    4.1 研究背景
    4.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
    4.3 實(shí)驗(yàn)材料
        4.3.1 菌株及質(zhì)粒
        4.3.2 PCR引物
        4.3.3 培養(yǎng)基及化學(xué)試劑
        4.3.4 抗生素及使用濃度
        4.3.5 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.3.6 DNA序列分析軟件
    4.4 實(shí)驗(yàn)方法
        4.4.1 質(zhì)粒DNA提取:BACs和質(zhì)粒
        4.4.2 鏈霉菌基因組DNA提取
        4.4.3 紡錘鏈霉菌SD-07 Large part克隆
            4.4.3.1 BAC線(xiàn)性載體的制備
                4.4.3.1.1 11BACPCR擴(kuò)增
                4.4.3.1.2 12 pBeloBAC11載體酶切處理
                4.4.3.1.3 過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌GBdir-gyrA462
                4.4.3.1.4 制備大腸桿菌GBdir-gyrA462感受態(tài)細(xì)胞
                4.4.3.1.5 構(gòu)建載體13 pBeloBAC11
                4.4.3.1.6 13 pBeloBAC11酶切處理
            4.4.3.2 基因組DNA的限制性酶切以釋放目標(biāo)基因簇
            4.4.3.3 過(guò)夜培養(yǎng)大腸桿菌GBdir+pSC101
            4.4.3.4 制備大腸桿菌GBdir+pSC101感受態(tài)
            4.4.3.5 T4 DNA聚合酶使基因組DNA的和線(xiàn)性載體初步重組
            4.4.3.6 電穿孔法使基因組DNA的和線(xiàn)性載體導(dǎo)入大腸桿菌
            4.4.3.7 限制酶切分析篩選出正確的重組子
        4.4.4 紡錘鏈霉菌SD-07 Small part克隆
            4.4.4.1 線(xiàn)性載體25 pBR322構(gòu)建
                4.4.4.1.1 載體25 pBR322組成片段PCR擴(kuò)增
                4.4.4.1.2 載體25 pBR322初步重組
                4.4.4.1.3 構(gòu)建載體25 pBR322
                4.4.4.1.4 載體25 pBR322的酶切
            4.4.4.2 基因組DNA的和線(xiàn)性載體初步重組
            4.4.4.3 Small part克隆至載體25 pBR322
    4.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論
        4.5.1 Large part克隆及限制酶切篩選分析
            4.5.1.1 SD-07基因組及Large part載體構(gòu)建
            4.5.1.2 Large part克隆酶切篩選
        4.5.2 Small part克隆及限制酶切篩選分析
            4.5.2.1 Small part載體構(gòu)建
            4.5.2.2 Small part克隆酶切篩選
    4.6 本章總結(jié)
全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
附件


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]產(chǎn)廣譜高效多烯類(lèi)抗真菌抗生素的紡錘鏈霉菌SD-07（Streptomyces netropsis）的分離及鑒定[J]. 金建玲,王寵,雷濤,高培基.  山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版). 2009(05)
[2]雷帕霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌NRRL5491接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立[J]. 楊旻,陶美鳳.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2007(05)

碩士論文
[1]紅樹(shù)林來(lái)源Streptomyces sp.OUC6819中多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的生物合成研究[D]. 張慧.中國(guó)海洋大學(xué) 2013
[2]紅色糖多孢菌基因敲除和SACE0069基因功能研究[D]. 古明珠.華東理工大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3211869