馬鈴薯是世界第三大、中國(guó)第四大糧食作物,我國(guó)已把馬鈴薯列為主糧提出了21世紀(jì)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略,馬鈴薯單產(chǎn)總體呈緩慢上升趨勢(shì),但種種病害在馬鈴薯種植過(guò)程中影響其生長(zhǎng)發(fā)育,最終影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中,對(duì)各種病害發(fā)展出自己的防御機(jī)制。類受體激酶是一種可以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育并適應(yīng)脅迫的信號(hào)分子,其中富含半胱氨酸的類受體激酶（CRK）在植物抗病和細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中起到重要的作用。目前對(duì)CRK基因功能的研究主要集中于水稻、小麥、擬南芥、番茄等植物中,馬鈴薯中的報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)將pMDI35S:GFP雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染馬鈴薯底西芮外植體,獲得4個(gè)GFP轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系,利用RT-qPCR篩選GFP表達(dá)量最高的品系。利用CRISPR/Cas9技術(shù),構(gòu)建了編輯GFP基因的兩個(gè)載體。分析馬鈴薯中StCRK1和StCRK2的CDS序列,預(yù)測(cè)靶位點(diǎn),構(gòu)建了編輯StCRK1基因的兩個(gè)載體及StCRK2基因的一個(gè)載體,為后續(xù)馬鈴薯StCRK1/2基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 植物免疫系統(tǒng)
        1.1.1 初級(jí)免疫系統(tǒng)
        1.1.2 次級(jí)免疫系統(tǒng)
        1.1.3 系統(tǒng)獲得抗性
    1.2 植物類受體激酶
    1.3 富含半胱氨酸的植物類受體激酶
        1.3.1 富含半胱氨酸的植物類受體激酶的結(jié)構(gòu)
        1.3.2 富含半胱氨酸的植物類受體激酶的功能
    1.4 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)
        1.4.1 基因編輯技術(shù)
        1.4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展
        1.4.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能
        1.4.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類
        1.4.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
            1.4.5.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動(dòng)物中的應(yīng)用
            1.4.5.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用
            1.4.5.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在馬鈴薯中的應(yīng)用
    1.5 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 相關(guān)試劑及藥品
        2.1.4 培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 相關(guān)溶液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 DH10B大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備
            2.2.1.1 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)
            2.2.1.2 大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.1.3 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)
        2.2.2 質(zhì)粒的提取
        2.2.3 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建
            2.2.3.1 靶點(diǎn)選擇
            2.2.3.2 sgRNA cassette構(gòu)建
            2.2.3.3 pCAMBIA1300-pYAO:Cas9雙元載體構(gòu)建
        2.2.4 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的獲得及鑒定
            2.2.4.1 農(nóng)桿菌的制備
            2.2.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯的轉(zhuǎn)化
            2.2.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯
        3.1.1 pMDI35S:GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化馬鈴薯
        3.1.2 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
            3.1.2.1 基因組水平檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯GFP基因
            3.1.2.2 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯GFP基因表達(dá)量檢測(cè)
    3.2 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯GFP基因
        3.2.1 靶點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 sgRNA cassette構(gòu)建
        3.2.3 雙元載體的構(gòu)建
        3.2.4 GFP編輯載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯
    3.3 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯馬鈴薯StCRK1/2基因載體的構(gòu)建
        3.3.1 靶點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)
        3.3.2 sgRNA cassette構(gòu)建
        3.3.3 雙元載體的構(gòu)建
4 結(jié)論與討論
    4.1 結(jié)論
    4.2 討論
        4.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用及存在的問(wèn)題
        4.2.2 本研究中存在的問(wèn)題及原因分析
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3204159