異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一。由鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）感染引起的鯽造血器官壞死癥是一種嚴(yán)重的病毒性傳染病,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,開展鯽魚抗病毒防御機(jī)制研究對其病毒性疾病的防控具有重要的現(xiàn)實意義。干擾素（Interferon,IFN）是一類重要的分泌型細(xì)胞因子,能夠抑制病毒增殖和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,在先天性和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著重要作用。目前,I型干擾素（IFN-I）已在多種硬骨魚類中得到研究,但有關(guān)異育銀鯽IFN-I的研究還未深入開展。本研究克隆獲得一種異育銀鯽IFN-I基因（CagIFNa）,完成了對該基因的鑒定和序列結(jié)構(gòu)分析,分析了CagIFNa在體內(nèi)和體外的表達(dá)模式,并對CagIFNa在鯽魚腦細(xì)胞系（Gibel carp brain cell line,GiCB）中抵抗CyHV-2感染的抗病毒活性進(jìn)行了研究。旨在進(jìn)一步揭示魚類先天性抗病毒感染機(jī)制,為鯽魚皰疹病毒造血器官壞死癥的有效防控奠定理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.CagIFNa的克隆和序列結(jié)構(gòu)分析基于R... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表(按字母順序排列)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 硬骨魚類Ⅰ型干擾素研究進(jìn)展
        1.1 Ⅰ型干擾素的種類及表達(dá)特征
            1.1.1 Ⅰ型干擾素的種類
            1.1.2 Ⅰ型干擾素的表達(dá)特征
        1.2 硬骨魚類Ⅰ型干擾素受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
            1.2.1 Ⅰ型干擾素受體
            1.2.2 Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
        1.3 硬骨魚類Ⅰ型干擾素抗病毒功能及其應(yīng)用
            1.3.1 Ⅰ型干擾素抗病毒功能
            1.3.2 Ⅰ型干擾素應(yīng)用
    2 鯉皰疹病毒Ⅱ型研究進(jìn)展
        2.1 流行病學(xué)
            2.1.1 流行區(qū)域
            2.1.2 傳播特征
        2.2 臨床癥狀及病理特征
        2.3 病原學(xué)
        2.4 檢測技術(shù)
            2.4.1 電鏡技術(shù)
            2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
            2.4.3 分子生物學(xué)檢測
                2.4.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
                2.4.3.2 實時熒光定量PCR
                2.4.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)
    3 魚類免疫系統(tǒng)的研究
第二章 異育銀鯽Ⅰ型干擾素的克隆及生物信息學(xué)分析
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 實驗動物、質(zhì)粒和菌種
            1.1.2 主要試劑及耗材
            1.1.3 主要實驗儀器
        1.2 實驗方法
            1.2.1 異育銀鯽組織樣品RNA提取
            1.2.2 異育銀鯽組織樣品c DNA合成
            1.2.3 5'RACE-Ready c DNA和3'RACE-Ready c DNA合成
            1.2.4 RACE法擴(kuò)增異育銀鯽IFN-Ⅰ基因c DNA部分序列
            1.2.5 PCR產(chǎn)物膠回收
            1.2.6 PCR產(chǎn)物的連接與轉(zhuǎn)化
            1.2.7 陽性克隆的篩選與測序鑒定
            1.2.8 普通PCR擴(kuò)增確定Cag IFNa ORF序列全長
            1.2.9 生物信息學(xué)分析
    2 實驗結(jié)果
        2.1 異育銀鯽IFN-Ⅰ(Cag IFNa)核苷酸序列與氨基酸序列分析
        2.2 Cag IFNa氨基酸多序列比對分析
        2.3 Cag IFNa氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
    3 討論
第三章 異育銀鯽Ⅰ型干擾素組織表達(dá)分布與誘導(dǎo)表達(dá)
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 實驗動物
            1.1.2 細(xì)胞及病毒
            1.1.3 實驗試劑及耗材
            1.1.4 實驗儀器及設(shè)備
        1.2 實驗方法
            1.2.1 CyHV-2 的培養(yǎng)與病毒滴度測定
            1.2.2 健康異育銀鯽各組織Cag IFNa的本底表達(dá)分析
            1.2.3 異育銀鯽感染CyHV-2 后頭腎和脾臟中Cag IFNa時序表達(dá)分析
            1.2.4 Poly I:C刺激和CyHV-2 感染后GiCB細(xì)胞中Cag IFNa時序表達(dá)分析
            1.2.5 熒光定量PCR引物設(shè)計及實驗方法
            1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2 實驗結(jié)果
        2.1 健康異育銀鯽Cag IFNa的組織表達(dá)分布
        2.2 異育銀鯽感染CyHV-2 后頭腎和脾臟中Cag IFNa時序表達(dá)模式
        2.3 Poly Ⅰ:C刺激和CyHV-2 感染GiCB細(xì)胞后Cag IFNa時序表達(dá)模式
    3 討論
第四章 異育銀鯽Ⅰ型干擾素真核表達(dá)載體構(gòu)建及抗病毒活性研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 細(xì)胞和病毒
            1.1.2 實驗試劑及耗材
            1.1.3 實驗儀器及耗材
        1.2 實驗方法
            1.2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-Cag IFNa的構(gòu)建
                1.2.1.1 Cag IFNa ORF片段的克隆
                1.2.1.2 Cag IFNa ORF與 pCMV-HA-N質(zhì)粒的酶切與連接
                1.2.1.3 pCMV-HA-Cag IFNa超純質(zhì)粒的提取
            1.2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-Cag IFNa轉(zhuǎn)染GiCB細(xì)胞
            1.2.3 Western-blot驗證Cag IFNa基因的過表達(dá)
            1.2.4 GiCB細(xì)胞中過表達(dá)Cag IFNa后抗病毒活性研究
                1.2.4.1 細(xì)胞病變觀察及病毒滴度測定
                1.2.4.2 熒光定量PCR檢測病毒基因及Ⅰ型干擾素信號通路相關(guān)基因的表達(dá)
            1.2.5 數(shù)據(jù)分析
    2 實驗結(jié)果
        2.1 pCMV-HA-Cag IFNa表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.1 Cag IFNa基因ORF擴(kuò)增
            2.1.2 陽性克隆篩選
        2.2 免疫印跡檢測HA-Cag IFNa蛋白在GiCB細(xì)胞中的表達(dá)
        2.3 GiCB細(xì)胞感染CyHV-2 后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后CyHV-2 病毒滴度及病毒相關(guān)基因檢測
        2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后IFN-Ⅰ系統(tǒng)相關(guān)基因的檢測
    3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號：3199265