石油從開采到最終使用的各個環(huán)節(jié)中導致的石油泄漏已造成嚴重的環(huán)境污染,微生物修復技術(shù)是治理石油環(huán)境污染最有前景的方法,掌握菌株的烷烴降解機理,是后期構(gòu)建基因工程菌及利用該技術(shù)的關(guān)鍵。Dietzia屬菌具有廣譜的烴類降解能力和良好的高鹽、高堿耐受能力,已成為研究放線菌烷烴降解的模式菌株。本研究以大慶油田分離的Dietzia sp.DQ12-45-1b為研究菌株,利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)pTip-ist AB-sacB和pRTSK-sacB,構(gòu)建了庫容為30,720的隨機突變體文庫。隨機挑選的突變克隆及突變克隆傳代20次后的Southern blot結(jié)果表明:轉(zhuǎn)座序列插入的隨機性較好、均為單插入突變,并且該突變文庫具有較好的遺傳穩(wěn)定性,可用于長期篩選功能基因。我們設計了高通量的正十六烷降解利用基因篩選方法,經(jīng)過固體培養(yǎng)基初篩、固體培養(yǎng)基復篩、液體培養(yǎng)基復篩多重篩選,成功篩出Dietzia sp.DQ12-45-1b的七個降解利用正十六烷相關(guān)功能基因:Contig3-orf00026（編碼DUF4263結(jié)構(gòu)蛋白）、Contig8-orf00015（編碼假定蛋白）、Contig8-orf00068（編碼鐵... 

【文章來源】：合肥工業(yè)大學安徽省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 石油污染及治理技術(shù)
        1.1.1 石油污染
        1.1.2 石油污染修復方法
    1.2 微生物感應、吸收、降解石油烴研究進展
        1.2.1 微生物對石油烴的感應機制
        1.2.2 微生物對石油烴的吸收途徑
        1.2.3 石油烴的微生物好氧降解途徑
        1.2.4 烷烴的厭氧微生物降解途徑
    1.3 影響微生物降解石油的因素
        1.3.1 石油烴的組成及濃度
        1.3.2 環(huán)境的溫度、pH值及鹽度
        1.3.3 微生物自身的特點
    1.4 迪茨氏屬菌的研究進展
        1.4.1 迪茨氏屬菌的特征
        1.4.3 迪茨氏菌屬菌生物修復
    1.5 構(gòu)建、篩選突變體文庫
    1.6 研究目的、內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.6.1 研究目的
        1.6.2 研究內(nèi)容
        1.6.3 研究路線
第二章 材料與方法
    2.1 菌株與質(zhì)粒
    2.2 儀器、試劑與引物
        2.2.1 儀器
        2.2.2 試劑
        2.2.3 引物
    2.3 培養(yǎng)基
    2.4 DQ12-45-1B隨機突變體文庫的構(gòu)建
        2.4.1 DQ12-45-1b感受態(tài)細胞的制備
        2.4.2 DQ12-45-1b基因組DNA的提取
        2.4.3 雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DQ12-45-1b感受態(tài)細胞
        2.4.4 DQ12-45-1b隨機突變體文庫的構(gòu)建
        2.4.5 Southern blot雜交方法
        2.4.6 突變體插入位點隨機性、插入拷貝數(shù)及傳代穩(wěn)定性的檢測
    2.5 DQ12-45-1b隨機突變體文庫的篩選
        2.5.1 正十六烷降解利用基因的篩選與鑒定
        2.5.2 突變位點檢測
    2.6 敲除菌株的構(gòu)建
        2.6.1 基因敲除步驟
        2.6.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.6.3 菌液抗性復蘇
        2.6.4 敲除菌株的驗證
    2.7 回補菌株的構(gòu)建
    2.8 本章小結(jié)
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 DQ12-45-1b隨機突變體文庫的構(gòu)建
        3.1.1 DQ12-45-1b隨機突變體文庫的構(gòu)建
        3.1.2 突變體文庫的構(gòu)建質(zhì)量
    3.2 正十六烷降解利用基因的篩選
        3.2.1 固體培養(yǎng)基上正十六烷滴加量的梯度實驗
        3.2.2 正十六烷降解利用基因的固體培養(yǎng)基初篩
        3.2.3 正十六烷降解利用基因的固體培養(yǎng)基復篩
        3.2.4 正十六烷降解利用基因的液體培養(yǎng)基復篩
        3.2.5 目的突變株的Southern blot結(jié)果
        3.2.6 突變位點檢測
        3.2.7 目的突變株的插入位點鑒定分析
    3.3 目的基因的敲除驗證
    3.4 基因Contig8-orf00068、Contig8-orf00071、Contig8-orf00074的回補驗證
    3.5 本章小結(jié)
第四章 主要結(jié)論與展望
    4.1 主要結(jié)論
    4.2 展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間的學術(shù)活動及成果情況



本文編號：3198868