目的:1.設(shè)計(jì)三個(gè)靶向于SMYD3基因的sgRNA。分別記為sgRNA#1、sgRNA#2和sgRNA#3。2.構(gòu)建sgRNA#1-PX459、sgRNA#2-PX459和sgRNA#3-PX459重組質(zhì)粒。3.檢測SMYD3蛋白在HEK293T細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞中的表達(dá)情況。4.探索Lipofectamine?2000:1μg的sgRNA-PX459重組質(zhì)粒最佳的包裹比例。5.比較不同濃度嘌呤霉素分別作用于HEK293T細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞,確定三天時(shí)最低致死濃度。6.比較CRISPR/Cas9打靶載體的活性。7.制備SMYD3基因缺陷型Bel-7402細(xì)胞株。8.比較SMYD3基因缺陷型Bel-7402細(xì)胞株與野生型Bel-7402細(xì)胞的增殖能力。9.比較SMYD3基因缺陷型Bel-7402細(xì)胞株與野生型Bel-7402細(xì)胞的遷移能力。方法:1.在GenBank網(wǎng)站,搜索人SMYD3基因序列。在http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站,設(shè)計(jì)靶向于SMYD3基因的sgRNA。2.使PX459質(zhì)粒線性化,把sgRNA連接入線性化的PX459,構(gòu)建sgRNA-PX4... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
常用縮寫詞中英文對照表
前言
1 實(shí)驗(yàn)材料
    1.1 細(xì)胞株
    1.2 菌株
    1.3 質(zhì)粒
    1.4 主要試劑
    1.5 實(shí)驗(yàn)所需引物
    1.6 實(shí)驗(yàn)器材
    1.7 主要試劑配制
2 實(shí)驗(yàn)方法
    2.1 質(zhì)粒準(zhǔn)備
    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
    2.3 WesternBlot檢測SMYD3蛋白在HEK293T細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞中的表達(dá)
    2.4 CRISPR/Cas9打靶載體的構(gòu)建與驗(yàn)證
    2.5 優(yōu)化脂質(zhì)體最佳負(fù)載量
    2.6 嘌呤霉素對HEK293T細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞最低致死濃度篩選
    2.7 CRISPR/Cas9打靶活性檢測
    2.8 Bel-7402細(xì)胞SMYD3基因缺陷型單克隆細(xì)胞株制備
    2.9 WesternBlot法檢測SMYD3蛋白在單克隆細(xì)胞株的表達(dá)
    2.10 靶目的DNA片段測序驗(yàn)證
    2.11 SMYD3敲除后對細(xì)胞功能的影響
    2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 PX459質(zhì)粒測序結(jié)果
    3.2 sgRNA設(shè)計(jì)結(jié)果
    3.3 PX459酶切結(jié)果
    3.4 菌液PCR鑒定陽性sgRNA-PX459重組質(zhì)粒
    3.5 sgRNA-PX459重組質(zhì)粒測序結(jié)果
    3.6 細(xì)胞培養(yǎng)
    3.7 WesternBlot檢測SMYD3蛋白在HEK293T細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞中的表達(dá)
    3.8 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
    3.9 PCR產(chǎn)物分子量大小驗(yàn)證引物的有效性
    3.10 測序驗(yàn)證靶位點(diǎn)PCR引物
    3.11 打靶載體活性檢測
    3.12 WesternBlot檢測SMYD3蛋白表達(dá)
    3.13 篩選SMYD3基因缺陷性Bel-7402細(xì)胞株
    3.14 cck-8法檢測細(xì)胞增殖
    3.15 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間研究成果
個(gè)人簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基因組編輯技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景[J]. 謝科,饒力群,李紅偉,安學(xué)麗,方才臣,萬向元.  中國生物工程雜志. 2013(06)
[2]shRNA干擾SMYD3對肝癌細(xì)胞c-Myc表達(dá)及凋亡的影響[J]. 劉鑫,陳立波,葉進(jìn),江軍,何軍,徐鋆耀,錢偉.  世界華人消化雜志. 2008(13)
[3]Silencing SMYD3 in hepatoma demethylates RIZI promoter induces apoptosis and inhibits cell proliferation and migration[J]. Li-Bo Chen, Jun-Yao Xu, Zhen Yang, Guo-Bin Wang Li-Bo Chen, Guo-Bin Wang, Hepatobiliary center, Union Hospital of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430022, Hubei province, China Jun-Yao Xu, Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-seu University, Guangzhou 510120, Guangdong province, China Zhen Yang, Department of integrated surgery, Tongji Hospital of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2007(43)



本文編號：3198136