柑橘是世界產(chǎn)量第一的水果,由于童期長(zhǎng)、種子多胚、某些重要的商業(yè)品種育性低甚至不育等特點(diǎn),利用傳統(tǒng)的育種方法改良柑橘進(jìn)展緩慢。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為近幾年快速發(fā)展的基因組編輯技術(shù)可以精確有效地誘導(dǎo)特定的突變,特異地改造基因組,已成為植物基因功能研究和作物遺傳改良的重要手段之一。利用植物原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變得到的植株,屬于非轉(zhuǎn)基因種質(zhì)資源,能夠省去漫長(zhǎng)的后代篩選步驟;同時(shí)相對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柑橘上胚軸易產(chǎn)生嵌合體,原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)是對(duì)于單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行基因編輯,得到純合子的概率大大提高。由于柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系尚未成熟,本研究旨在優(yōu)化柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,提高柑橘葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率,以充分利用亞細(xì)胞定位、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)對(duì)柑橘本物種基因進(jìn)行功能研究;提高柑橘愈傷組織原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率,以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改良柑橘種質(zhì);引進(jìn)3種不同的CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建體系,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)山金柑上胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化法對(duì)目的基因CsP5CS2進(jìn)行敲除,以期得到陽(yáng)性植株用于后期的基因功能研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 課題的提出
    1.2 植物原生質(zhì)體研究進(jìn)展
        1.2.1 植物原生質(zhì)體特點(diǎn)
        1.2.2 植物原生質(zhì)體分離
        1.2.3 植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法
        1.2.4 PEG介導(dǎo)的植物原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率
        1.2.5 植物原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的應(yīng)用
    1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用
        1.3.1 基因組編輯技術(shù)概述
        1.3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制
        1.3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化與發(fā)展
        1.3.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用
    1.4 柑橘CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.5 本實(shí)驗(yàn)研究的目的及內(nèi)容
2 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與載體
        2.1.3 主要試劑與酶
        2.1.4 培養(yǎng)基與溶液配方
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 載體構(gòu)建方法
            2.2.1.1 CRISPR/Cas9載體pRGE31-CsP5CS2
            2.2.1.2 CRISPR/Cas9載體pKSE-GFP-CsP5CS2
            2.2.1.3 亞細(xì)胞定位載體
        2.2.2 柑橘原生質(zhì)體提取與純化
        2.2.3 柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法
        2.2.4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法
        2.2.5 柑橘U6啟動(dòng)子CsU6的擴(kuò)增
3 結(jié)果與分析
    3.1 原生質(zhì)體提取與純化步驟優(yōu)化
    3.2 原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響因素評(píng)價(jià)
        3.2.1 原生質(zhì)體材料來(lái)源
        3.2.2 共轉(zhuǎn)化處理方式
        3.2.3 PEG溶液Ca~(2+)濃度
    3.3 利用柑橘原生質(zhì)體研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位
    3.4 利用柑橘原生質(zhì)體研究蛋白質(zhì)互作-BiFC
    3.5 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        3.5.1 利用tRNA-gRNA體系構(gòu)建CsSPL基因單靶位點(diǎn)編輯載體
        3.5.2 利用tRNA-gRNA體系構(gòu)建CsP5CS2基因雙靶位點(diǎn)編輯載體
        3.5.3 構(gòu)建pKSE-GFP-CsP5CS2編輯載體
        3.5.4 構(gòu)建Cas9/CsU6體系編輯載體
    3.6 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)山金柑上胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.6.1 轉(zhuǎn)基因過(guò)程
        3.6.2 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株序列分析
4 討論
    4.1 柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系比較
    4.2 3種不同CRISPR/Cas9載體比較
    4.3 柑橘愈傷組織原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率低的可能原因
參考文獻(xiàn)
附錄 Ⅰ 培養(yǎng)基配方
附錄 Ⅱ 溶液配方
附錄 Ⅲ 柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法二
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物CRISPR基因組編輯技術(shù)的新進(jìn)展[J]. 李紅,謝卡斌.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(10)
[2]基因組編輯技術(shù)在植物基因功能鑒定及作物育種中的應(yīng)用[J]. 周想春,邢永忠.  遺傳. 2016(03)
[3]木本植物原生質(zhì)體培養(yǎng)體系研究進(jìn)展[J]. 彭邵鋒,陸佳,陳永忠,王瑞,陳隆升,馬力,王湘南.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2013(01)
[4]植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究進(jìn)展[J]. 邢浩然,劉麗娟,劉國(guó)振.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2006(S2)
[5]世界柑橘品種改良的進(jìn)展[J]. 鄧秀新.  園藝學(xué)報(bào). 2005(06)
[6]植物體細(xì)胞原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化研究[J]. 趙宏波,陳發(fā)棣.  西北植物學(xué)報(bào). 2004(07)

博士論文
[1]柑橘珠心胚起始相關(guān)miRNA挖掘與csi-miR156a調(diào)控體細(xì)胞胚發(fā)生作用機(jī)理[D]. 龍健梅.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的棉花GhCLA1和GhVP基因編輯的研究[D]. 陳修貴.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點(diǎn)編輯研究[D]. 朱金潔.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[4]轉(zhuǎn)基因調(diào)控柑橘類(lèi)胡蘿卜素積累的細(xì)胞學(xué)和代謝研究[D]. 曹洪波.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012

碩士論文
[1]柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立及默科特橘橙轉(zhuǎn)GFP種質(zhì)的創(chuàng)造[D]. 張倩.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3185518