低溫是限制植物分布、生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要因素。低溫脅迫條件下,很多生物過程,如光合作用、蛋白質(zhì)合成、膜脂代謝和次生代謝都會(huì)受到影響。生物膜是低溫傷害的初始位點(diǎn),低溫時(shí)植物首先發(fā)生膜脂的物相變化,從液晶相轉(zhuǎn)為凝膠相,植物對低溫的抗性與膜脂的不飽和脂肪酸含量密切相關(guān)。玉米是全世界范圍內(nèi)種植面積最大的作物種類之一,也是我國重要的糧食作物、飼料作物和工業(yè)原料。玉米屬于亞熱帶或熱帶作物,其最適生長溫度在25-28℃之間,全生育期所需的積溫大于10℃,當(dāng)溫度低于12℃時(shí),玉米植株就很容易受到低溫脅迫。在早春播種時(shí),玉米經(jīng)常遭受低溫脅迫,影響種子萌發(fā)和幼苗生長,甚至?xí)斐纱竺娣e的缺苗,導(dǎo)致播種時(shí)期延誤,最終導(dǎo)致減產(chǎn)。因此,深入研究玉米耐低溫的生理和分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。本研究利用玉米自交系為實(shí)驗(yàn)材料,從生理生化、轉(zhuǎn)錄組和分子生物學(xué)等方面探究其耐低溫的機(jī)理,并篩選參與其耐低溫的關(guān)鍵基因,為利用生物技術(shù)培育耐低溫玉米新品系奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:（1）抗低溫和不抗低溫玉米自交系的篩選以102個(gè)玉米自交系為材料,4℃低溫處理兩周后,通過觀察表型,先初步篩選出其中較抗低溫的M54、W54、2... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：146 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 低溫脅迫對植物的影響
        1.1.1 低溫脅迫對植物生物膜的影響
        1.1.2 低溫對植物光合作用的影響
        1.1.3 低溫對植物PSⅡ的影響
        1.1.4 低溫對植物PSⅠ的影響
        1.1.5 低溫條件下的光破壞防御機(jī)制
            1.1.5.1 依賴于葉黃素循環(huán)的熱耗散
            1.1.5.2 活性氧清除系統(tǒng)
        1.1.6 植物抗低溫分子生物學(xué)研究進(jìn)展
    1.2 玉米低溫脅迫研究進(jìn)展
    1.3 次生代謝物質(zhì)在作物抗逆中的作用
        1.3.1 植物酚類化合物的分類
        1.3.2 酚類化合物在植物中的生理功能
    1.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆中的作用及分子機(jī)理
    1.5 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究進(jìn)展
    1.6 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料及材料的培養(yǎng)方法
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 耐低溫和不耐低溫玉米自交系的篩選
            2.2.1.1 幼苗生理指標(biāo)的測定
            2.2.1.2 隸屬函數(shù)綜合評價(jià)方法
        2.2.2 低溫脅迫下玉米生理指標(biāo)的測定
            2.2.2.1 玉米熒光參數(shù)的測定
            2.2.2.2 玉米膜脂含量的測定
            2.2.2.3 玉米幼苗H_2O_2含量的測定
            2.2.2.4 玉米幼苗O_2~(·?)產(chǎn)生速率的測定
            2.2.2.5 玉米幼苗抗氧化酶活性的測定
            2.2.2.6 玉米幼苗總酚含量的測定
            2.2.2.7 玉米幼苗類黃酮含量的測定
        2.2.3 玉米轉(zhuǎn)錄組的測定及差異表達(dá)基因分析
            2.2.3.1 RNA的提取和純化
            2.2.3.2 測序文庫的構(gòu)建和Illumina測序
            2.2.3.3 測序reads的去噪、拼接
            2.2.3.4 與參考基因組比對、表達(dá)量的計(jì)算及差異表達(dá)基因篩選
            2.2.3.5 差異表達(dá)基因的功能注釋
        2.2.4 RealtimePCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果
        2.2.5 玉米MYB31和MYB-IF35基因的分離
            2.2.5.1 玉米總RNA的提取
            2.2.5.2 cDNA第一條鏈的合成
            2.2.5.3 cDNA純化
            2.2.5.4 MYB31和MYB-IF35基因的克隆
        2.2.6 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.6.1 正義表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.6.2 DNA序列測定
            2.2.6.3 根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
        2.2.7 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥
            2.2.7.1 花序侵染
            2.2.7.2 過表達(dá)株系的抗生素篩選
            2.2.7.3 過表達(dá)株系在DNA水平上的鑒定
        2.2.8 玉米MYB31和MYB-IF35基因的亞細(xì)胞定位
            2.2.8.1 pROKⅡ-GFP載體的構(gòu)建
            2.2.8.2 pROKⅡ-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            2.2.8.3 pROKⅡ-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位
        2.2.9 數(shù)據(jù)分析軟件
3 結(jié)果與分析
    3.1 玉米抗低溫和不抗低溫自交系的篩選
        3.1.1 低溫對玉米自交系生長狀況的影響
        3.1.2 低溫對玉米自交系生理指標(biāo)的影響
        3.1.3 8個(gè)玉米自交系抗低溫能力的綜合評價(jià)
    3.2 低溫對玉米自交系M54和753F生長及生理指標(biāo)的影響
        3.2.1 低溫處理不同時(shí)間對M54和753F中marker基因表達(dá)和幼苗生長的影響
        3.2.2 低溫處理不同時(shí)間對M54和753F熒光參數(shù)的影響
        3.2.3 低溫處理不同時(shí)間對M54和753F活性氧含量和抗氧化酶活性的影響
        3.2.4 低溫處理不同時(shí)間對M54和753F類黃酮和總酚含量的影響
        3.2.5 低溫處理不同時(shí)間對M54和753F膜脂和脂肪酸含量的影響
    3.3 利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序預(yù)測玉米自交系抗低溫的分子機(jī)理
        3.3.1 RNA-seq測序質(zhì)量評估
        3.3.2 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)比對效率統(tǒng)計(jì)
        3.3.3 差異表達(dá)基因及其功能注釋
        3.3.4 差異表達(dá)基因的GO及COG注釋
        3.3.5 差異表達(dá)基因的KEGG注釋
        3.3.6 RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
        3.3.7 低溫脅迫下光合作用過程相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選
        3.3.8 低溫脅迫下膜脂代謝過程相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選
        3.3.9 低溫脅迫下次生代謝過程相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選
        3.3.10 低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選
    3.4 玉米次生代謝途徑中參與抗低溫關(guān)鍵基因的篩選及功能分析
        3.4.1 玉米次生代謝途徑中參與抗低溫關(guān)鍵基因的進(jìn)一步篩選
        3.4.2 玉米MYB31和MYB-IF35基因的分離
        3.4.3 玉米MYB31和MYB-IF35基因一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析
        3.4.4 玉米MYB31和MYB-IF35蛋白與其他蛋白序列的同源性分析
        3.4.5 玉米MYB31和MYB-IF35基因的亞細(xì)胞定位
        3.4.6 玉米MYB31和MYB-IF35基因過表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4.7 DNA水平上擬南芥過表達(dá)株系的篩選鑒定
        3.4.8 RNA水平上過表達(dá)株系的篩選鑒定
        3.4.9 MYB31和MYB-IF35的過量表達(dá)提高擬南芥的抗低溫能力
            3.4.9.1 過量表達(dá)MYB31和MYB-IF35擬南芥的表型分析
            3.4.9.2 玉米MYB31和MYB-IF35的過量表達(dá)對低溫脅迫下相對電導(dǎo)率的影響
            3.4.9.3 MYB31和MYB-IF35的過量表達(dá)對低溫脅迫下PSⅡ光化學(xué)效率的影響
            3.4.9.4 MYB31和MYB-IF35的過量表達(dá)對低溫脅迫下SOD和APX活性的影響
            3.4.9.5 MYB31和MYB-IF35的過量表達(dá)對低溫脅迫下O2·?和H2O2含量的影響
4 討論
    4.1 玉米自交系M54和753F的抗低溫能力分析
    4.2 差異表達(dá)基因所在的通路與低溫響應(yīng)分析
        4.2.1 光合作用過程相關(guān)基因在玉米響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用
        4.2.2 膜脂代謝過程相關(guān)基因可能參與玉米對低溫脅迫響應(yīng)
        4.2.3 次生代謝過程相關(guān)基因在玉米響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用
    4.3 轉(zhuǎn)錄因子在玉米響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用
    4.4 次生代謝途徑中參與玉米低溫響應(yīng)的關(guān)鍵基因
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文及成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]西瓜低溫響應(yīng)MYB（Cla007586）轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定及互作蛋白分析[D]. 高凌云.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016



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