罕見病一般是指發(fā)病率低,患病人群較少的疾病,其中一類罕見病統(tǒng)稱為溶酶體貯積癥,葡萄糖腦苷脂病是一種家族性糖脂代謝疾病,也屬于該類罕見病。該疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,其有效的治療方法主要為酶替代療法。為了提高β-葡萄糖腦苷脂酶在酶替代療法中的作用效力,其終端甘露糖殘基須暴露在糖鏈外端,以使其能夠與溶酶體內(nèi)的甘露糖受體結(jié)合,從而作用于葡萄糖腦苷脂酶底物進(jìn)行消化,達(dá)到治療此病的目的。而β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（GNT1）是哺乳動物細(xì)胞糖蛋白N端糖鏈加工的關(guān)鍵酶之一,能催化糖鏈由甘露糖型向雜合型轉(zhuǎn)變。敲除GNT1基因可以提高甘露糖糖型含量,使其暴露在糖鏈終端。本研究利用新型的基因編輯工具規(guī)律成簇短回文重復(fù)CRISPRCas9 RNA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶,對表達(dá)葡萄糖腦苷脂酶的CHO細(xì)胞進(jìn)行了基因改造。通過設(shè)計針對目的基因GNT1的單引導(dǎo)RNA,引導(dǎo)CRISPR-Cas9核酸內(nèi)切酶對GNT1基因進(jìn)行了敲除,成功構(gòu)建了GNT1基因敲除的單克隆細(xì)胞株。最終檢測得出該細(xì)胞株表達(dá)產(chǎn)物β-葡萄糖腦苷脂酶中甘露糖糖型含量從0.5%上升至94.1%,目的產(chǎn)物酶活提高約24%。高甘露糖糖型含量能顯著提高... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 罕見病的定義及現(xiàn)狀
    1.2 溶酶體貯積癥簡介
    1.3 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)
        1.3.1 基因編輯簡介
        1.3.2 新型基因編輯工具
        1.3.3 CRISPR基因編輯技術(shù)簡介
        1.3.4 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的應(yīng)用
    1.4 研究目的與研究思路
第二章 實(shí)驗材料與方法
    2.1 實(shí)驗材料與試劑
        2.1.1 實(shí)驗細(xì)胞
        2.1.2 實(shí)驗用質(zhì)粒
        2.1.3 實(shí)驗用試劑
        2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑及材料
        2.1.5 實(shí)驗設(shè)備及儀器
    2.2 實(shí)驗方法
        2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)及凍存方法
        2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法
        2.2.3 細(xì)胞有限稀釋法
        2.2.4 細(xì)胞流加培養(yǎng)實(shí)驗
        2.2.5 葡萄糖腦苷脂酶酶活檢測實(shí)驗
        2.2.6 sgRNA引物設(shè)計
        2.2.7 sgRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.8 T7E1核酸酶檢測實(shí)驗方法
    2.3 實(shí)驗流程
第三章 GNT1基因敲除單克隆細(xì)胞株的成功構(gòu)建
    3.1 sgRNA評估結(jié)果
    3.2 篩選敲除GNT1基因單克隆
    3.3 敲除GNT1基因的單克隆流加實(shí)驗結(jié)果
    3.4 敲除GNT1基因單克隆目的產(chǎn)物酶糖型分析結(jié)果
    3.5 實(shí)驗結(jié)果討論
第四章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的論文



本文編號：3170732