基因組編輯技術(shù)尤其是新興的CRISPR/Cas9系統(tǒng),能高效地對基因組進(jìn)行靶向修飾,理論上可以實現(xiàn)任何物種任何基因的編輯,對生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等都展示出巨大的研究價值。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)依賴于DNA片段的同源重組,效率低（低于10-6）。相對于ZFNs和TALENs的復(fù)雜組裝,CRISPR/Cas9系統(tǒng)依靠guide RNA和Cas9蛋白就可以實現(xiàn)基因定點編輯,具有構(gòu)建簡單、打靶效率高、成本低等優(yōu)點。本實驗設(shè)計利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別在小鼠ES細(xì)胞和胚胎水平實現(xiàn)基因定點敲除,并獲得單等位基因敲除小鼠模型。本課題以小鼠母源印記基因Kcnq1ot1作為敲除對象。該基因位于Kcnq1ot1印記基因簇中并起調(diào)控作用。本課題第一條技術(shù)路線為ES細(xì)胞介導(dǎo)的囊胚注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠,策略為敲除Kcnq1ot1啟動子以及其起始部位共3.7 kb長DNA片段,并敲入puroeGFP。在敲除片段5’和3’端各找了3個靶位點并成功構(gòu)建基于靶位點的6個gRNA和打靶載體Kcnq1ot1-puro-eGFP-pGalk。將打靶載體、Cas9表達(dá)質(zhì)粒和5’gRNA-1及3’gRNA-1共轉(zhuǎn)染至小鼠ES細(xì)胞,... 

【文章來源】：河南大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 基因組編輯技術(shù)
        1.1.1 鋅指核酸酶技術(shù)
        1.1.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)
        1.1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
    1.2 幾種常用的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)
        1.2.1 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的囊胚注射法
        1.2.2 基于受精卵的原核注射或胞質(zhì)注射
        1.2.3 體細(xì)胞核移植
    1.3 基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用
        1.3.1 研究基因功能
        1.3.2 基因治療
        1.3.3 制備醫(yī)學(xué)動物疾病模型
        1.3.4 利用基因組編輯技術(shù)改良動物遺傳性狀
    1.4 印記基因和細(xì)胞重編程
    1.5 立題依據(jù)和研究意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 載體
        2.1.2 菌株、細(xì)胞系和小鼠品系
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 常用培養(yǎng)基和緩沖液的配制
        2.1.6 引物序列(金唯智)
    2.2 實驗方法
        2.2.1 打靶載體的制備
        2.2.2 gRNA的構(gòu)建
        2.2.3 小鼠成纖維細(xì)胞的制備
        2.2.4 小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.5 小鼠ES細(xì)胞電轉(zhuǎn)染
        2.2.6 陽性ES細(xì)胞篩選
        2.2.7 ES細(xì)胞介導(dǎo)的囊胚注射及子宮移植
        2.2.8 受精卵介導(dǎo)的原核注射及輸卵管移植
3 結(jié)果與分析
    3.1 ES細(xì)胞介導(dǎo)的敲除小鼠制備結(jié)果
        3.1.1 ES細(xì)胞水平CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的Kcnq1ot1基因敲除
        3.1.2 gRNA構(gòu)建結(jié)果
        3.1.3 囊胚注射及嵌合體小鼠
    3.2 受精卵原核注射介導(dǎo)的敲除小鼠制備的結(jié)果
        3.2.1 胚胎水平載體構(gòu)建及gRNA效率檢測結(jié)果
        3.2.2 原核注射結(jié)果
4 討論
    4.1 關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)
    4.2 制作動物模型方法的比較
    4.3 動物模型
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：3169854