目的:近年來,肺癌以其不斷攀升的發(fā)病率和死亡率迅速成為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性疾病之一。因此,找尋在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的有效生物學標志對提高肺癌患者的生命質(zhì)量和生存時間具有非常重要的意義。pre-mRNA的可變剪接是控制基因表達和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機制,也是引起癌癥表達的天然來源。許多癌基因受可變剪接調(diào)控,而某一個或某些可變剪接異構(gòu)體的轉(zhuǎn)換,可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用,成為癌癥的特異性可變剪接模式。PPP1R13L是一種新的癌基因,存在2個常見可以編碼蛋白的可變剪接異構(gòu)體PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV,兩者在環(huán)境致癌物所致肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮不同的生物學功能,呈現(xiàn)出某種肺癌特異性可變剪接模式。本研究通過基因芯片和生物數(shù)據(jù)庫等方法篩選與肺癌相關(guān)的癌基因PPP1R13L的可變剪接異構(gòu)體,并采用臨床肺癌及癌旁組織樣本、BPDE誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化模型及體外細胞轉(zhuǎn)染模型深入挖掘和探討PPP1R13L基因兩個候選可變剪接異構(gòu)體在肺癌變過程中的特征表達和相關(guān)機制。闡明高表達PPP1R13L-SV可以通過抑制P53的凋亡功能,促進細胞惡性轉(zhuǎn)變,認為PPP1R13L-S... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體在肺癌組織中的表達及其特征分析
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 研究對象的確定
            2.2.2 Affymetrix基因芯片和UCSC數(shù)據(jù)庫篩選PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體
            2.2.3 組織樣本DNA提取
            2.2.4 DNA及RNA擴增引物信息
            2.2.5 DNA擴增
            2.2.6 組織總RNA提取
            2.2.7 實時定量PCR檢測
            2.2.8 組織蛋白提取及Western blot
            2.2.9 5'-RACE-Ready cDNA末端擴增檢測
        2.3 統(tǒng)計學方法
    3 結(jié)果
        3.1 基因芯片及生物信息學篩選PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體
        3.2 肺癌、癌旁及遠端(非癌)組織中PPP1R13L-L和PPP1R13L-SVmRNA及蛋白表達水平
        3.3 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53在肺癌組織與癌旁組織中mRNA表達水平
        3.4 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53基因mRNA表達水平與肺癌臨床病理特征關(guān)聯(lián)性的分層分析
        3.5 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53蛋白在肺癌組織與癌旁組織中的表達
        3.6 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53表達水平與肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性
        3.7 PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體在肺鱗癌中的表達與P53之間的相關(guān)性
    4 討論
第二部分 PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體在BPDE所致人正常支氣管上皮永生化細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的特征分析
    5 前言
    6 材料與方法
        6.1 主要試劑和儀器
            6.1.1 主要試劑
            6.1.2 主要儀器
            6.1.3 細胞來源
        6.2 實驗方法
            6.2.1 細胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)
            6.2.2 CCK8試驗篩選BPDE對16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑量
            6.2.3 16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化模型的構(gòu)建
            6.2.4 劃痕實驗
            6.2.5 Transwell小室體外侵襲實驗
            6.2.6 軟瓊脂克隆實驗
            6.2.7 裸鼠成瘤實驗
            6.2.8 成瘤組織HE染色
            6.2.9 成瘤組織免疫組化
            6.2.10 實時定量PCR檢測不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53 mRNA表達
            6.2.11 蛋白免疫印跡法檢測不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表達
            6.2.12 統(tǒng)計學方法
    7 結(jié)果
        7.1 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細胞的遷移能力
        7.2 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細胞的侵襲能力
        7.3 惡性轉(zhuǎn)化不同代數(shù)細胞的惡性增殖能力
        7.4 惡性轉(zhuǎn)化細胞皮下致瘤
        7.5 惡性轉(zhuǎn)化細胞的病理學鑒定
            7.5.1 成瘤組織病理分析
            7.5.2 成瘤組織免疫組化鑒定
        7.6 惡性轉(zhuǎn)化細胞P53基因型分析
        7.7 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53mRNA表達水平
        7.8 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表達
    8 討論
第三部分 構(gòu)建體外細胞轉(zhuǎn)染模型分析PPP1R13L兩種不同可變剪接模式在肺癌變中的作用及機制
    9 前言
    10 材料與方法
        10.1 主要試劑和儀器
            10.1.1 主要試劑
            10.1.2 主要儀器
            10.1.3 細胞來源
        10.2 實驗方法
            10.2.1 構(gòu)建PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV過表達質(zhì)粒
            10.2.2 設(shè)計并篩選PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV短片斷干擾RNA(siRNA)
            10.2.3 利用CRISPR-Cas9體系構(gòu)建PPP1R13L-L轉(zhuǎn)錄本敲除細胞模型
            10.2.4 各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞效果的鑒定
            10.2.5 BPDE染毒處理轉(zhuǎn)染細胞的凋亡檢測
            10.2.6 BPDE染毒處理轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測
            10.2.7 統(tǒng)計學方法
    11 結(jié)果
        11.1 PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV在各轉(zhuǎn)染細胞中mRNA及蛋白表達水平
        11.2 PPP1R13L不同可變剪接模式與細胞凋亡的關(guān)系
        11.3 siRNA干擾PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體對P53核內(nèi)表達的影響
        11.4 外源性質(zhì)粒過表達PPP1R13L不同可變剪接異構(gòu)體對P53核內(nèi)表達的影響
        11.5 CRISPR-Cas9體系內(nèi)源性敲除PPP1R13L-L各轉(zhuǎn)染細胞中PPP1R13L不同可變剪接異構(gòu)體蛋白表達水平
        11.6 CRISPR-Cas9細胞模型中PPP1R13L不同轉(zhuǎn)錄本表達模式與細胞凋亡的關(guān)系
        11.7 CRISPR-Cas9細胞模型中PPP1R13L不同轉(zhuǎn)錄本表達模式對P53核內(nèi)表達的影響
    12 討論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]新一代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9研究進展[J]. 宣詔卿.  當代化工研究. 2017(09)
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博士論文
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碩士論文
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[2]擬南芥形態(tài)和生理進化的比較研究[D]. 劉陽.山東農(nóng)業(yè)大學 2015
[3]p53凋亡刺激蛋白抑制因子（IASPP）在膠質(zhì)瘤中的表達及其作用機制的研究[D]. 潘曉虎.蘇州大學 2013
[4]癌基因iASPP-SV/iASPP在乳腺癌中的表達及其與P53關(guān)系的實驗研究[D]. 趙燕儀.天津醫(yī)科大學 2007



本文編號：3166966