目的:近年來,肺癌以其不斷攀升的發(fā)病率和死亡率迅速成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病之一。因此,找尋在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的有效生物學(xué)標(biāo)志對提高肺癌患者的生命質(zhì)量和生存時間具有非常重要的意義。pre-mRNA的可變剪接是控制基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制,也是引起癌癥表達(dá)的天然來源。許多癌基因受可變剪接調(diào)控,而某一個或某些可變剪接異構(gòu)體的轉(zhuǎn)換,可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用,成為癌癥的特異性可變剪接模式。PPP1R13L是一種新的癌基因,存在2個常見可以編碼蛋白的可變剪接異構(gòu)體PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV,兩者在環(huán)境致癌物所致肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮不同的生物學(xué)功能,呈現(xiàn)出某種肺癌特異性可變剪接模式。本研究通過基因芯片和生物數(shù)據(jù)庫等方法篩選與肺癌相關(guān)的癌基因PPP1R13L的可變剪接異構(gòu)體,并采用臨床肺癌及癌旁組織樣本、BPDE誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型及體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型深入挖掘和探討PPP1R13L基因兩個候選可變剪接異構(gòu)體在肺癌變過程中的特征表達(dá)和相關(guān)機(jī)制。闡明高表達(dá)PPP1R13L-SV可以通過抑制P53的凋亡功能,促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變,認(rèn)為PPP1R13L-S... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體在肺癌組織中的表達(dá)及其特征分析
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 研究對象的確定
            2.2.2 Affymetrix基因芯片和UCSC數(shù)據(jù)庫篩選PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體
            2.2.3 組織樣本DNA提取
            2.2.4 DNA及RNA擴(kuò)增引物信息
            2.2.5 DNA擴(kuò)增
            2.2.6 組織總RNA提取
            2.2.7 實(shí)時定量PCR檢測
            2.2.8 組織蛋白提取及Western blot
            2.2.9 5'-RACE-Ready cDNA末端擴(kuò)增檢測
        2.3 統(tǒng)計學(xué)方法
    3 結(jié)果
        3.1 基因芯片及生物信息學(xué)篩選PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體
        3.2 肺癌、癌旁及遠(yuǎn)端(非癌)組織中PPP1R13L-L和PPP1R13L-SVmRNA及蛋白表達(dá)水平
        3.3 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53在肺癌組織與癌旁組織中mRNA表達(dá)水平
        3.4 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53基因mRNA表達(dá)水平與肺癌臨床病理特征關(guān)聯(lián)性的分層分析
        3.5 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53蛋白在肺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)
        3.6 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53表達(dá)水平與肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性
        3.7 PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體在肺鱗癌中的表達(dá)與P53之間的相關(guān)性
    4 討論
第二部分 PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體在BPDE所致人正常支氣管上皮永生化細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的特征分析
    5 前言
    6 材料與方法
        6.1 主要試劑和儀器
            6.1.1 主要試劑
            6.1.2 主要儀器
            6.1.3 細(xì)胞來源
        6.2 實(shí)驗(yàn)方法
            6.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)
            6.2.2 CCK8試驗(yàn)篩選BPDE對16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑量
            6.2.3 16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的構(gòu)建
            6.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)
            6.2.5 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)
            6.2.6 軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)
            6.2.7 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
            6.2.8 成瘤組織HE染色
            6.2.9 成瘤組織免疫組化
            6.2.10 實(shí)時定量PCR檢測不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53 mRNA表達(dá)
            6.2.11 蛋白免疫印跡法檢測不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表達(dá)
            6.2.12 統(tǒng)計學(xué)方法
    7 結(jié)果
        7.1 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遷移能力
        7.2 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的侵襲能力
        7.3 惡性轉(zhuǎn)化不同代數(shù)細(xì)胞的惡性增殖能力
        7.4 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞皮下致瘤
        7.5 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的病理學(xué)鑒定
            7.5.1 成瘤組織病理分析
            7.5.2 成瘤組織免疫組化鑒定
        7.6 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞P53基因型分析
        7.7 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53mRNA表達(dá)水平
        7.8 不同代數(shù)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表達(dá)
    8 討論
第三部分 構(gòu)建體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型分析PPP1R13L兩種不同可變剪接模式在肺癌變中的作用及機(jī)制
    9 前言
    10 材料與方法
        10.1 主要試劑和儀器
            10.1.1 主要試劑
            10.1.2 主要儀器
            10.1.3 細(xì)胞來源
        10.2 實(shí)驗(yàn)方法
            10.2.1 構(gòu)建PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV過表達(dá)質(zhì)粒
            10.2.2 設(shè)計并篩選PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV短片斷干擾RNA(siRNA)
            10.2.3 利用CRISPR-Cas9體系構(gòu)建PPP1R13L-L轉(zhuǎn)錄本敲除細(xì)胞模型
            10.2.4 各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效果的鑒定
            10.2.5 BPDE染毒處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡檢測
            10.2.6 BPDE染毒處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光檢測
            10.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法
    11 結(jié)果
        11.1 PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV在各轉(zhuǎn)染細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)水平
        11.2 PPP1R13L不同可變剪接模式與細(xì)胞凋亡的關(guān)系
        11.3 siRNA干擾PPP1R13L可變剪接異構(gòu)體對P53核內(nèi)表達(dá)的影響
        11.4 外源性質(zhì)粒過表達(dá)PPP1R13L不同可變剪接異構(gòu)體對P53核內(nèi)表達(dá)的影響
        11.5 CRISPR-Cas9體系內(nèi)源性敲除PPP1R13L-L各轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PPP1R13L不同可變剪接異構(gòu)體蛋白表達(dá)水平
        11.6 CRISPR-Cas9細(xì)胞模型中PPP1R13L不同轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式與細(xì)胞凋亡的關(guān)系
        11.7 CRISPR-Cas9細(xì)胞模型中PPP1R13L不同轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式對P53核內(nèi)表達(dá)的影響
    12 討論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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[2]miRNA-124靶向調(diào)控PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和侵潤[D]. 趙衛(wèi)華.中南大學(xué) 2014

碩士論文
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[2]擬南芥形態(tài)和生理進(jìn)化的比較研究[D]. 劉陽.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]p53凋亡刺激蛋白抑制因子（IASPP）在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其作用機(jī)制的研究[D]. 潘曉虎.蘇州大學(xué) 2013
[4]癌基因iASPP-SV/iASPP在乳腺癌中的表達(dá)及其與P53關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 趙燕儀.天津醫(yī)科大學(xué) 2007



本文編號：3166966