目的:構(gòu)建靶向低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒,并體外鑒定其敲除效果。方法:設(shè)計靶向HIF-1α基因的gRNA序列,將其插入到CRISPR/Cas9質(zhì)粒骨架載體p CAG-T7中,轉(zhuǎn)化后挑取克隆,進(jìn)行測序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞Hep G2和SK-Hep-1,利用嘌呤霉素進(jìn)行篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)獲得HIF-1α基因敲除混合克隆細(xì)胞,應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和混合克隆細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:經(jīng)測序驗(yàn)證,成功構(gòu)建了靶向HIF-1α的重組質(zhì)粒p CAG-T7-HIF-1α-gRNA,經(jīng)Western blot驗(yàn)證,轉(zhuǎn)染該重組質(zhì)粒后人肝癌細(xì)胞株Hep G2和SK-Hep-1經(jīng)Co Cl2誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)明顯減弱。結(jié)論:成功構(gòu)建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒載體。 

【文章來源】：鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2016,51(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要試劑
    1.2 靶向HIF-1α基因的gRNA的設(shè)計和合成
    1.3 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA載體的構(gòu)建及鑒定
    1.4 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA對肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
    1.5 細(xì)胞中HIF-1α蛋白的Western blot法檢測
2 結(jié)果
    2.1 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA的鑒定
    2.2 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA對Hep G2、SK-Hep-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果
    2.3 基因敲除效果
3 討論



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