戊型肝炎已經(jīng)成為全球重要的公共衛(wèi)生問題,戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）是戊型肝炎（Hepatitis E,HE）的病原體。我國是HE的高發(fā)地區(qū),1986年-1988年,在我國新疆曾發(fā)生HE的大暴發(fā),共發(fā)病119280例,罹患率2.96%。國家法定傳染病報告結(jié)果顯示,近年來,中國HE病例數(shù)呈持續(xù)上升趨勢。本研究建立了一種用于檢測HEV的巢式RT-PCR方法,對四川省大部分地區(qū)HEV感染情況進行調(diào)查。在此基礎(chǔ)上,通過克隆分析HEV ORF2部分區(qū)域,分析其遺傳進化情況,為確定我國HEV標(biāo)準(zhǔn)株的研究打下基礎(chǔ)。另外,對已建立的HEV感染大鼠模型進行組織嗜性,抗體水平,轉(zhuǎn)氨酶水平及組織病理情況等方面的觀察,根據(jù)觀察結(jié)果分析大鼠模型的感染過程,為HEV致病機制的研究打下基礎(chǔ)。本研究通過比對國內(nèi)外20株戊型肝炎病毒的序列,針對戊型肝炎多種基因型的ORF2基因部分保守區(qū)域設(shè)計內(nèi)、外兩對,擴增片段大小為638bp的巢式PCR引物,對其退火溫度進行優(yōu)化,建立了HEV巢式RT-PCR檢測方法,對得到的片段進行克隆并測序。結(jié)果顯示,用該方法對豬戊型肝炎陽性病料進行檢測,目的片段與預(yù)... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

HEV巢式RT-PCR退火溫度的優(yōu)化

27圖1-1HEV巢式RT-PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.1-1OptimizationtestofHEVnestedRT-PCRannealingtemperatureM：DL2000DNAMarker；1-7：退火溫度依次為50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃1-7:Theannealingtemperaturearefrom50℃,51℃,52℃,53℃,54℃,55℃,56℃,respectively3.2陽性質(zhì)粒pMD19-T-HEV的鑒定將經(jīng)巢式PCR擴增得到的HEVORF2部分基因片段與Vector（Simple）連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。用巢式RT-PCR對陽性質(zhì)粒和空載進行鑒定，結(jié)果顯示陽性質(zhì)粒目的片段大小與預(yù)期一致，說明該片段已成功克隆到了pMD19-T載體上（圖1-2）。圖1-2陽性質(zhì)粒的鑒定Fig.1-2Identificationofpositiveplasmids

28M:DL2000DNAMarker;1-3:pMD19-T-HEV;4:陰性對照M:DL2000DNAMarker;1-3:pMD19-T-HEV;4:Negativecontrol3.3敏感性試驗結(jié)果核酸蛋白儀測得質(zhì)粒濃度為135ng/μL，用已巢式RT-PCR方法對已知濃度的質(zhì)粒進行檢測，結(jié)果顯示巢式RT-PCR可檢測到的病毒濃度范圍為1.35ng/μL~13.5fg/μL，靈敏度可以達到13.5fg/μL(圖1-3)。結(jié)果證明，該方法的敏感性較高。圖1-3HEV巢式RT-PCR的敏感性試驗Fig.1-3SensitivitytestofnestedRT-PCRfordetectionofHEVM：DL2000DNAMarker；1：陽性對照；2-8：樣品濃度依次為1.35ng/μL，135pg/μL，13.5pg/μL，1.35pg/μL，135fg/μL，13.5fg/μL，1.35fg/μL；9：陰性對照M:DL2000DNAMarker;1:positivecontrol;2-8:Thesampleconcentrationarefrom1.35ng/μL，135pg/μL，13.5pg/μL，1.35pg/μL，135fg/μL，13.5fg/μL，1.35fg/μL,respectively;9:Negativecontrol3.4特異性試驗結(jié)果用已建立的巢式RT-PCR方法對ProVA、CSFV、TGEV、PEDV、PRRSV和HEV陽性質(zhì)粒進行檢測，結(jié)果顯示只有HEV陽性質(zhì)粒能夠擴增出條帶（圖1-4），證明所建立的方法具有很強的特異性。

【參考文獻】：
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本文編號：3146698