特定核酸或基因序列的檢測在臨床診斷,基因突變,生物防衛(wèi)等領(lǐng)域有著至關(guān)重要的應(yīng)用價值。近年來,研究者一直致力于發(fā)展更靈敏和簡便的生物傳感器技術(shù)用于特定核酸的檢測。其中,熒光生物傳感器具有操作簡單、選擇性好、響應(yīng)快速等優(yōu)點而成為重要的研究方向。然而,目前的熒光生物傳感器技術(shù)大多需要標(biāo)記和借助納米材料來達(dá)到進(jìn)行信號放大的目的。本研究設(shè)計了三種無需標(biāo)記和納米材料就能實現(xiàn)信號擴(kuò)增的熒光生物傳感器,并對其可行性、工作條件和性能開展了詳細(xì)地研究,為開發(fā)出靈敏度高、操作簡單和成本低廉的熒光生物傳感器具有重要的參考價值。主要結(jié)果如下:1.基于核酸外切酶III（Exo III）介導(dǎo)的級聯(lián)熒光信號放大策略,構(gòu)建了一種無需標(biāo)記的熒光生物傳感器,實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌mecA基因的高靈敏度和操作簡便的檢測。該設(shè)計中發(fā)夾探針（hairpine probe,HP）作為識別元件和信號報告元件,行使著目標(biāo)序列識別和信號報告的功能;當(dāng)mecA目標(biāo)基因不存在時,HP不能被Exo III消化,因而富含G的核酸序列被限制在HP探針的莖端;當(dāng)存在mecA基因時,會與HP互補(bǔ)雜交形成3’為平末端的雙鏈,引起Exo III的消化反應(yīng)... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【圖文】：

SGI的分子結(jié)構(gòu)圖

第一章文獻(xiàn)綜述3圖1.1SGI的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1.1MolecularstructureofSGIChen等人報道了一種以SGI為信號的免標(biāo)記檢測雙酚A的等溫信號放大的熒光技術(shù)[21]。原理如圖1.2所示，當(dāng)沒有目標(biāo)物存在時，雙鏈DNA1/DNA2、發(fā)夾探針A、B和C都會被核酸外切酶III（ExoIII）水解，形成ssDNA和單個堿基的碎片。當(dāng)加入目標(biāo)物后，DNA1與目標(biāo)物特異性結(jié)合，DNA1中引發(fā)鏈置換反應(yīng)的引發(fā)鏈片段被暴露出來。然后引發(fā)鏈與發(fā)夾探針A結(jié)合，接著再與發(fā)夾探針B結(jié)合，最后與發(fā)夾探針C結(jié)合，形成3’突出末端的dsDNA，同時釋放出引發(fā)鏈。被釋放的引發(fā)鏈與剩下的發(fā)夾探針A、B和C開始新一輪的鏈置換反應(yīng)，最終體系中存在大量dsDNA。加入SGI染料，體系就會產(chǎn)生顯著的熒光信號。因而就可以實現(xiàn)對目標(biāo)物進(jìn)行高靈敏度的檢測分析，該體系的檢測限低至5fM。利用SGI為信號的方法還被用于microRNA、ATP、T4PNK和Hg2+的檢測[22-25]。圖1.2SYRBGreenI為信號檢測雙酚A的原理圖Fig.1.2SchematicrepresentationofamplifiedfluorescencebisphenolAdetectionusingSYRBGreenIasthesignalreporter

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文4G-四聯(lián)體（G-quadruplex）是由富含鳥嘌呤的核酸序列構(gòu)成的四鏈DNA納米結(jié)構(gòu)[26]。在K+、NH4+等陽離子的介導(dǎo)下，富含鳥嘌呤的DNA鏈可以折疊形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)[27]。一些熒光染料可以與G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的分析檢測。這些染料包括N-甲基卟啉二丙酸IX（NMM），四（二異丙基胍基）酞氰鋅（Zn-DIGP）、硫黃素T（ThioflavinT，ThT）和原卟啉（PPIX）等。NMM是一種常用的能與G-四聯(lián)體結(jié)合的熒光染料，分子結(jié)構(gòu)如圖1.3所示。當(dāng)NMM處于游離狀態(tài)時，熒光信號十分微弱；當(dāng)存在G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)時，NMM能與G-四聯(lián)體結(jié)合，然后產(chǎn)生十分顯著的熒光信號[28]。NMM對單鏈、雙鏈和三鏈都不會產(chǎn)生特異性結(jié)合反應(yīng)[29]。圖1.3NMM的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1.3MolecularstructureofNMMLi等人報道了一種以G-四聯(lián)體為信號的免標(biāo)記檢測三磷酸腺苷的等溫信號放大的熒光技術(shù)[30]。原理如圖1.4所示，當(dāng)沒有ATP存在時，體系無法發(fā)生鏈置換反應(yīng)，含有G-四聯(lián)體的核酸鏈被牢牢的綁住，導(dǎo)致體系中熒光信號很弱。但加入ATP之后，ATP與三鏈DNA復(fù)合探針中的ATP適配體結(jié)合，使得該復(fù)合探針的構(gòu)型發(fā)生變化，并導(dǎo)致支點區(qū)域的暴露，燃料DNA隨后雜交到該區(qū)域上，通過支點介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)釋放出G-四聯(lián)體序列和ATP。被釋放的ATP可以循環(huán)再利用，使得體系中產(chǎn)生大量的G-四聯(lián)體序列。這些G-四聯(lián)體序列能與NMM結(jié)合產(chǎn)生顯著的熒光信號。因而就可以實現(xiàn)對目標(biāo)物進(jìn)行高靈敏度的檢測分析，該體系的檢測限低至25nM。利用G-四聯(lián)體為報告信號的方法還被用于DNA、KF聚合酶、生物硫醇和Ag+的檢測[31-34]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]LncRNA與結(jié)直腸癌診斷治療的研究進(jìn)展[J]. 潘雪峰,范乃軍,高春芳.  腫瘤學(xué)雜志. 2017(02)
[2]KRAS基因突變與結(jié)直腸癌研究進(jìn)展[J]. 張釗,劉勝利.  東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2016(01)
[3]金黃色葡萄球菌在蔬菜中生長狀況分析[J]. 劉曉慧,郭鳳柳,賈月梅,熊蕊,王建華,趙同欣,王娜,顏紅,呂燕.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(08)
[4]結(jié)直腸癌流行病學(xué)趨勢[J]. 李道娟,李倩,賀宇彤.  腫瘤防治研究. 2015(03)
[5]兒童耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染致嚴(yán)重膿毒癥12例分析[J]. 陳雨青,金丹群,盧松建.  臨床兒科雜志. 2015(01)
[6]高分辨率熔解曲線分析技術(shù)檢測EGFR基因突變方法的建立及其初步臨床應(yīng)用[J]. 王卓,井昶雯,曹海霞,馬蓉,吳建中.  中國腫瘤外科雜志. 2014(04)
[7]用辣根過氧化物酶生物傳感器測定啤酒中的過氧化氫[J]. 馮東,李雪梅,王丙蓮,李大海,劉仲匯.  釀酒科技. 2011(12)
[8]五種方法在不同溫度下檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的評價[J]. 章杰梅,張興,黃旦華.  實用醫(yī)學(xué)雜志. 2011(02)
[9]結(jié)直腸癌k-ras基因檢測及其靶向治療的研究現(xiàn)狀[J]. 王麗,余英豪.  世界華人消化雜志. 2011(01)
[10]人免疫缺陷病毒感染的實驗室檢測及進(jìn)展[J]. 鄭磊,賈立永,干寧,王前.  分子診斷與治療雜志. 2010(04)



本文編號：3146155